冻融处理赋予脱细胞基质 (dECM) 多尺度机械性能的可调性：一种优化组织工程生物材料的策略

冻融处理赋予脱细胞基质 (dECM) 多尺度机械性能的可调性：一种优化组织工程生物材料的策略

脱细胞化的目标是有效去除细胞，同时最大限度地保留ECM蛋白和天然基质结构。组织学染色dECM（对照组、F/T 3组和F/T 7组）证实了有效的脱细胞化，没有可见的细胞核（图1C）。对所有三组（对照组、F/T 3组和F/T 7组）的DNA含量进行定量分析，结果表明没有显著差异，并且所有三组dECM的DNA含量均符合文献中提出的低于50 ng/mg干重的标准（图1G）。剩余的多孔结构可以促进细胞渗透、迁移、营养物质运输和代谢产物的清除[33]。

考虑到胶原纤维二级结构的暴露会导致严重的免疫反应，因此采用差示扫描量热法 (DSC)、衰减全反射傅里叶变换红外光谱 (ATR-FTIR)、能量色散光谱 (EDS) 和 X 射线衍射 (XRD) 对胶原结构完整性进行了进一步确认[34]。吸热峰与胶原从三螺旋结构向无规卷曲结构的转变有关，峰值对应于变性温度 (Td)[35]。由肽 (Pro-Hyp-Gly)10 形成并通过链间氢键促进的胶原稳定三螺旋结构的典型Td 范围为 60 °C 到 90 °C[35,36]。在我们的研究中，我们观察到 F/T 3 组的吸热峰更高，为 80.3 °C，而对照组为 77.7 °C（图 1D）。这表明存在更多负责稳定胶原三螺旋的氢键。因此，DCS 测试中吸热峰的偏移通常被认为是原三螺旋结构完整性的指标[37,38]。

与 NH2 键合相关的 3500 cm−1 附近的宽带 (酰胺 A)，与羰基伸缩振动相关的 1647 cm−1 处的峰 (酰胺 I)，与 NH 变形和 CN 伸缩的振动源相关的 1550 cm−1 处的峰 (酰胺 II) 以及与 CN 伸缩和 NH 弯曲振动相关的 1241 cm−1 处的峰 (酰胺 III) 是 FTIR 光谱中胶原三螺旋结构最显著的特征[30]。作为肽构象的敏感标记，所有三组的光谱中都观察到了这些特征峰（图 1E），这表明脱细胞化方法没有破坏天然胶原的二级结构[39]。此外，EDS 图谱证实了 C、N、O、Na、Mg、Al、P 和 S 元素的存在和均匀分布，并且 EDS 光谱显示三组中元素的含量相似（图 S4，支持信息）。如图 1F 所示，所有三组的 dECM 都在 7°–8° 处显示了一个峰，对应于胶原的三螺旋结构，并在 20° 附近显示了一个宽峰，与纤维网络引起的漫反射有关[40,41]。此外，所有组都表现出高吸水能力和中性 pH 值（图 S5A、B，支持信息）。值得注意的是，SDS-PAGE 分析表明，dECM 的成分在整个冻融处理过程中基本保持不变（图 S5C，支持信息）。

良好的生物相容性是组织工程生物材料的先决条件。在本研究中，分别将 RAW 264.7 巨噬细胞和成纤维细胞接种到 dECM 上，并进行 CCK-8 测定以评估细胞增殖。与对照组相比，F/T 3 组和 F/T 7 组的细胞活力在第 3 天显著增加（图 1H）。冻融处理可以有效去除细胞成分，并通过形成细胞内冰晶和导致细胞裂解来减少异物反应，但过度使用冻融处理可能会导致结构损伤，并暴露胶原纤维二级结构，从而导致严重的免疫反应[34]。在我们的脱细胞化方案中，三个冻融循环可能足以去除细胞，同时最大限度地保留 ECM 蛋白和天然基质结构。此外，使用大鼠皮下模型评估了 dECM 的系统毒性。植入 4 块来自同一组的 10 mm × 10 mm 方形 dECM，所有大鼠均保持健康。在整个研究过程中，没有观察到感染、伤口裂开或伤口延迟愈合等并发症。考虑到 dECM 在一个月内完全降解，因此在第 28 天检查了重要器官的健康状况。在所有三组中，主要器官均未观察到病变（图 S6，支持信息）。由于保留了 dECM 的天然 3D 生物结构和生物活性成分，dECM 衍生的生物材料表现出良好的生物相容性[6]。

使用基质金属蛋白酶-1 (MMP-1) 研究了 dECM 的体外降解性，MMP-1 是主要的胶原酶，可以裂解 I 型和 III 型胶原[42]。对照组中超过 90% 的 dECM 已经降解，而在 F/T 3 组中，20% 的 dECM 在 48 小时内仍未溶解（图 1I）。这表明 dECM 的细胞外生物降解行为可以通过冻融处理来延长。

这些结果表明，所有三组的 dECM 均无细胞，并保持了胶原的构象和结构，并表现出良好的生物相容性和生物降解性。与以往研究一致，ECM 超微结构在冻融处理过程中得以相对完好地保留[32,43]。这可能创造出有利于三维结构组织生长的优化细胞微环境，进一步促进更好的生物相容性[44]。

2.2. 冻融处理赋予 dECM 多尺度机械性能的可调性

dECM 在多个长度尺度上的机械性能对其临床表现至关重要，因为机械刺激形塑了我们对生物材料的组织反应[31]。生物材料的宏观机械性能决定其工作特性和与器官或组织的相互作用，微观尺度则指导细胞反应，纳米尺度机械性能影响原位分子相互作用[45]。