AAV基因组制备及纯化方案

AAV基因组制备

为获取纯化的AAV基因组，我们采取以下步骤进行制备：

首先，对AAV样品中的核酸杂质进行酶解处理。将10 µL AAV样品与7 µL配方缓冲液、2 µL 10倍稀释的DNase I缓冲液以及1 µL稀释后的benzonase (溶于10 mM Tris‑HCl (pH 7.5), 2.5 mM MgCl2和0.1 mM CaCl2的1倍DNase I缓冲液)混合，总体积为20 µL。混合物于37°C孵育30分钟进行酶解反应。随后加入2 µL 50 mM EDTA和278 µL AAV配方缓冲液终止反应。

随后，使用Amicon离心过滤器(100 kDa截断)在14,000 × g下离心2分钟，去除benzonase和已降解的核酸。将离心过滤器单元倒置，以1,000 × g离心2分钟收集沉淀物，并使用95 µL AAV配方缓冲液进行稀释。

为解离AAV壳层，向样品中加入5 µL浓度为20 mg/mL的蛋白酶K，并在37°C下孵育2小时。

最后，使用含有硫酸胍的QIAquick PCR纯化试剂盒纯化游离的AAV基因组，并使用30 µL无核酸水进行洗脱。洗脱后的样品在70°C下孵育2分钟，然后置于冰上，准备进行CGE-LIF分析。