高通量单细胞全长转录本测序方法及细胞标签载体设计

本发明提供了一种高通量单细胞全长转录本测序方法，该方法包括以下步骤：

制备具有大量微孔的芯片；
将有限数量的细胞加入到微孔芯片表面，待细胞充分沉降后洗掉芯片表面没有沉降到孔内的多余细胞；
加入经过特殊设计的携带有细胞标签的mRNA捕获载体，将细胞在孔内原位裂解后，标签mRNA捕获载体即可捕获该单细胞所释放出来的mRNA；
反转录或者将所有捕获载体收集到一个反应容器中进行mRNA逆转录反应，生成对应的一端带有细胞标签的全长cDNA；
将一定分子数量的全长cDNA分子与转座酶复合体混合，在一定温度下转座酶复合体会随机插入并结合到DNA长分子上；
将带有转座酶复合体的cDNA分子和携带有大量特定分子标签（barcode）的载体共同孵育，随后控制反应体积，cDNA分子浓度，载体浓度以及反应时间，使每一个带有大量特定分子标签（barcode）的载体形成一个虚拟分割，该载体能捕获结合在长片段cDNA分子上的转座酶复合体，当cDNA长片段分子浓度足够低，而带有分子标签的载体数量足够多时，会使得落在一个载体形成的虚拟分隔内的cDNA分子，那么一个载体就只会捕获一条cDNA分子，载体捕获cDNA分子后，将载体上的Barcode与转座复合体的接头序列连起来，这样Barcode就连接到DNA片段上去了，然后释放转座酶，从而最终使一条长片段cDNA断裂成许多适合测序的短片段，并且这些来自同一个长片段cDNA分子的短片段上所带有的标签是相同的；
通过标签信息，将测序生成的短读长序列重新还原成原始长片段cDNA，再通过cDNA上同时携带的细胞标签和分子标签，确定每个cDNA的细胞来源，从而实现高通量单细胞全长转录本测序。

上述实施方式的实施路线分为四个部分：第一个部分为制备大量带有多拷贝特定标签序列（细胞标签和分子标签）的载体；第二个部分为将单细胞分离至微孔内，并使用一个带有细胞标签的载体捕获该单细胞内的信使RNA；第三部分为将逆转录后形成的cDNA与转座酶复合体进行结合；第四部分为分子标签载体杂交捕获带有转座复合体的全长cDNA，并将分子标签转移至cDNA上。

对于一种具体形式，细胞标签载体是将多条DNA分子乙连接至固相载体表面得到的；DNA分子乙由单链DNA分子C和单链DNA分子D组成，为部分双链结构；单链DNA分子C从5'→3'方向，依次由如下三个区段组成：5'端区段、中部区段和3'端区段；整个单链DNA分子D与单链DNA分子C的中部区段反向互补形成双链结构；单链DNA分子C的5'末端与固相表面连接；单链DNA分子C的3'端区段具有mRNA捕获区；单链DNA分子C的中部区段具有细胞标签。事实上，单链DNA分子C也可通过3'末端与固相表面连接。

对于一种具体形式，细胞标签载体是将特异DNA分子乙连接至固相表面得到的；特异DNA分子乙由单链DNA分子C和单链DNA分子D组成，为部分双链结构；单链DNA分子C从5'→3'方向，依次由如下三个区段组成：5'端区段、中部区段和3'端区段；整个单链DNA分子D与单链DNA分子C的中部区段反向互补形成双链结构；单链DNA分子C的5'末端与固相表面连接；单链DNA分子C的3'端区段自上游至下游依次具有独特转录本标签和mRNA捕获区；单链DNA分子C的中部区段具有细胞标签。事实上，单链DNA分子C也可通过3'末端与固相表面连接。

对于一种具体形式，分子标签载体是将多条DNA分子甲连接至固相载体表面得到的；DNA分子甲由单链DNA分子A和单链DNA分子B组成，为部分双链结构；单链DNA分子A从5'→ 3'方向，依次由如下三个区段组成：5'端区段、中部区段和3'端区段；整个单链DNA分子B与单链DNA分子A的中部区段反向互补形成双链结构；单链DNA分子A的5'端区段具有转座子捕获区；单链DNA分子A的3'末端与固相表面连接；单链DNA分子A的中部区段具有分子标签。事实上，单链DNA分子A也可通过5'末端与固相表面连接。

对于一种具体形式，固相为颗粒状固相。颗粒状固相具体可为磁珠或胶珠或二氧化硅珠等。

对于一种具体形式，细胞标签载体中，每个颗粒状固相的表面连接一种DNA分子乙；每个颗粒状固相的表面连接多条DNA分子乙；一种DNA分子乙，即序列相同的DNA分子乙。每个颗粒状固相表面具体可连接10000000条以上的DNA分子乙，优选连接100000000条以上的DNA分子乙，进一步优选连接500000000条以上的DNA分子乙。

对于一种具体形式，分子标签载体中，每个颗粒状固相的表面连接一种DNA分子甲；每个颗粒状固相的表面连接多条DNA分子甲；一种DNA分子甲，即序列相同的DNA分子甲。每个颗粒状固相表面具体可连接10000条以上的DNA分子甲，优选连接50000条以上的DNA分子甲，进一步优选连接80000条以上的DNA分子甲。

具体可采用500000种以上的细胞标签，优选1000000以上的细胞标签，进一步优选2000000以上的细胞标签。细胞标签中可以具有一组细胞标签或多组细胞标签（例如两组、三组等，以增加标签所代表的细胞数量）。对于一种具体形式，细胞标签由细胞标签1、间隔序列和细胞标签2组成。细胞标签1可以由4-50个核苷酸组成，优选由8-20个核苷酸组成。细胞标签1的设计原则为：由A、T、C、G四种核苷酸组成，每种核苷酸不能连续出现3次以上。细胞标签2可以由4-50个核苷酸组成，优选由8-20个核苷酸组成。细胞标签2的设计原则为：由A、T、C、G四种核苷酸组成，每种核苷酸不能连续出现3次以上。细胞标签1具体可由10个核苷酸组成。细胞标签2具体可由10个核苷酸组成。具体可采用1536种细胞标签1和1536种细胞标签2，从而得到2359296种细胞标签。具体可采用768种细胞标签1和384种细胞标签2，从而得到294912种细胞标签。

具体可采用500000种以上的分子标签，优选1000000以上的分子标签，进一步优选2000000以上的分子标签。分子标签中可以具有一组分子标签或多组分子标签（例如两组、三组等，以增加标签所代表的分子数量）。对于一种具体形式，分子标签由分子标签1、间隔序列和分子标签2组成。分子标签1可以由4-50个核苷酸组成，优选由8-20个核苷酸组成。分子标签1的设计原则为：由A、T、C、G四种核苷酸组成，每种核苷酸不能连续出现3次以上。分子标签2可以由4-50个核苷酸组成，优选由8-20个核苷酸组成。分子标签2的设计原则为：由A、T、C、G四种核苷酸组成，每种核苷酸不能连续出现3次以上。分子标签1具体可由10个核苷酸组成。分子标签2具体可由10个核苷酸组成。具体可采用1536种分子标签1和1536种分子标签2，从而得到2359296种分子标签。具体可采用768种分子标签1和384种分子标签2，从而得到294912种细胞标签。

请问细胞载体的结构组成是什么，又是如何进行连接的？

细胞载体是指具有细胞标签和mRNA捕获区的DNA分子，用于捕获单个细胞内的信使RNA。具体地，细胞标签载体由多条DNA分子乙构成，每个颗粒状固相的表面连接一种DNA分子乙，DNA分子乙由单链DNA分子C和单链DNA分子D组成，为部分双链结构。单链DNA分子C从5'→3'方向，依次由如下三个区段组成：5'端区段、中部区段和3'端区段；整个单链DNA分子D与单链DNA分子C的中部区段反向互补形成双链结构；单链DNA分子C的5'末端与固相表面连接；单链DNA分子C的3'端区段具有mRNA捕获区；单链DNA分子C的中部区段具有细胞标签。

细胞标签载体的连接方式是将多条DNA分子乙连接至固相载体表面得到的，具体为将单链DNA分子C的5'末端与固相表面连接。另外，细胞标签也可以通过3'末端与固相表面连接。