人体组织

第比利斯国立医科大学的伦理委员会批准了组织采集工作。已经获得知情同意。供体是健康的、没有并发症的足月妊娠妇女。胎盘是在标准临床护理下,在分娩后立即收集的。

动物

格鲁吉亚国家医学研究所批准了动物使用(许可证编号14-48)。动物可以自由进食和饮水。Wistar大鼠(n=30)年龄为8-10周,体重为200-250克,来自第比利斯国立医科大学的繁殖设施。大鼠手术使用醚麻醉。土耳其品种的母羊,体重为15-20公斤(n=27),来自格鲁吉亚的认证设施,单独放在圈舍中。麻醉时,绵羊肌肉注射0.03-0.05 mg/kg阿托品和0.5 mg/kg地西泮,然后静脉注射20 mg/kg氯胺酮和5 mg/kg哌嗪。为了镇痛,手术后立即肌肉注射1 mg/kg酮洛芬,随后连续3天。为了防止败血症,每天肌肉注射2 mg/kg庆大霉素和头孢曲松两次,共6天。在麻醉后,观察动物的恢复情况、正常活动以及出血或其他并发症。

组织脱细胞化

脐动脉和静脉被插管,并用含肝素的生理盐水冲洗。然后将胎盘存放在-80°C下。脱细胞化过程中,胎盘在回温至4°C后,通过动脉灌注磷酸缓冲盐水(PBS),pH值为7.4,连续3个24小时周期分别使用0.01%、0.1%和1%的十二烷基硫酸钠(SDS)溶液,流速为1毫升/分钟。为了去除SDS,胎盘用蒸馏水冲洗30分钟,用1%Triton X-100冲洗1小时,用PBS冲洗3小时。胎盘在含有青霉素和链霉素的PBS中存放在4°C下,最长可达7天,或者在排空PBS后无限期地存放在-80°C下。在某些情况下,胎盘被冷冻干燥并存放在-80°C下。

DNA含量

组织DNA被提取(G-spin试剂盒;iNtRON Biotechnology, Inc., Seongnam, Korea),并在260 nm处测量(NanoDrop 1000;ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA)。

脱细胞化胎盘的解剖学

对于血管解剖学,胎盘动脉和静脉被插管,用生理盐水冲洗以清除血液,并用50%水合乳胶(NAIRIT L-3, NAIRIT)或铅红(Pb3O4 + PbO [М-])在松节油中获得模型。对于血管造影,放射对比剂被注入胎盘动脉。对于电子显微镜(EM),样本被固定在戊二醛中,并在Tousimis Samdri-780关键点干燥器(Tousimis Research Corp., Rockville, MD)中干燥,随后对超薄切片进行金溅射(扫描电子显微镜,Hitachi Ltd., Tokyo, Japan)。

脱细胞化血管和移植

胎盘动脉段用水灌注12小时,并按照先前的描述使用肝素处理(11)。脱细胞化的动脉被1%硫酸前列腺素充满,压力为120 mmHg,用水灌洗30分钟,并浸泡在1000 U/ml肝素中48小时。血管在含有0.1%过氧乙酸的PBS中消毒3小时。为了测试机械强度,将1.5-2.5 mm直径、2.5-3 cm长的血管段两端插入聚丙烯导管,并用4-0丝线固定(Ethicon Inc., Somerville, NJ)。这些血管在37°C的正常盐水浴中浸泡,并且在一端增加压力,直到记录到视频中破裂。为了测试血管连接动脉缺损的能力,将大鼠的颈总动脉在结扎之间切断。根据Zou等人的方法,将具有0.7 mm外径和0.6 mm内径的聚乙烯套管分别应用于动脉的两端(11)。将动脉末端的边缘翻转到套管上,并用9-0缝线将脱细胞化的胎盘血管固定在套管上。手术后的5、10、15、30和40天处死大鼠。血管造影使用放射对比剂或荧光素。用福尔马林固定的移植物切片通过免疫染色进行观察,以检测desmin、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和von Willebrand因子(vWF)(Abcam, Cambridge, UK)。

羊肝的收获和处理以及脱细胞化胎盘的肝化

在中线腹部切口后,切除左肝叶(约30%,通常为110-120克),并结扎其蒂。通过门静脉分支用Hanks平衡盐溶液(HBSS)冲洗被切除的肝脏。肝脏用机械组织切割器在室温下切碎5-6分钟。这个时间是在早期的研究中确定的。通过两层手术纱布通过,去除大于1-2毫米大小的碎片,并将滤液收集在30毫升HBSS中。通过尝试蓝染色法确定碎片的存活性。碎片被甲醛固定用于组织学检查。对于肝化,将胎盘修剪到合适的尺寸,并通过灌洗生理盐水确认组织完整性。每个胎盘囊注射多达150毫升的肝脏碎片,每个胎盘叶注射10-15毫升,使用18-20号针头。通常,从脱细胞化胎盘制备到使用的时间小于30分钟。通过向血管注射有色乳胶来测试肝化胎盘。为了检测白蛋白分泌,每分钟以10毫升的速度注入RPMI 1640培养基,持续3天。每天存储培养基样品以测量白蛋白含量。为了尿素合成,将5毫摩尔氯化铵加入培养基中,持续1小时,并在此期间每天收集培养基。为了检测肝脏转运功能,将3.8兆贝克的99mTc–Bromo-Billaron(Medi-Radiopharma, Budapest, Hungary)注入胎盘动脉,并使用动态成像(

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