多柔比星诱导乳腺癌细胞衰老：一种新的肿瘤治疗策略

导言：乳腺癌是危及妇女生命和健康的重要原因之一，超声是乳腺癌筛查的重要手段之一。乳腺癌已进入全面治疗的时代。在过去30年中，以蒽环类化疗方案AC和EC为主的辅助治疗成为乳腺癌的主要方法。其中，多柔比星是一种非周期特异性药物，可抑制RNA和DNA的合成。然而，一些肿瘤细胞经过化疗后，并没有直接进入凋亡过程，而是被阻断在细胞周期的G0/G1期，绕过凋亡阶段进入衰老阶段，而衰老细胞并未能有效被清除，随后再生，导致肿瘤复发和药物耐药。衰老细胞处于细胞周期停滞状态，也可以长时间保持新陈代谢活跃，并释放衰老相关的分泌表型（SASP）。SASP表现为一系列炎症因子和基质重塑因子的分泌，导致邻近细胞的表观遗传变化，并为肿瘤微环境提供促进肿瘤生长的条件。因此，细胞衰老在肿瘤治疗过程中的出现是药物耐药产生的重要因素，针对衰老细胞是乳腺肿瘤治疗的新思路。

多柔比星化疗药物诱导乳腺癌细胞衰老

为了探索化疗药物多柔比星在诱导乳腺癌细胞衰老方面的适宜浓度和作用时间，通过CCK-8细胞毒性实验，将MCF7乳腺癌细胞用多柔比星处理，并在24小时后计算药物效应。半抑制浓度IC50为350.9 nM（图1A）。选择多柔比星浓度为250 nM，使MCF7存活率在2小时后达到70％，作为诱导衰老的工作浓度，并处理MCF7细胞。2小时后，撤除药物并更换无药物培养基。然后，我们设立了未处理组，并设置了药物撤除后1天、3天、5天和6天作为实验组的时间点，通过细胞衰老SA-β-Gal染色观察衰老时间点，并发现在多柔比星的作用下，随着药物撤除天数的延长，细胞衰老SA-β-Gal染色的阳性率逐渐增加，大约在5-6天时出现明显的衰老现象，阳性率高达70-80％（图1B）。

p53/p21 CIP1和p16 INK4a/pRB是导致细胞周期停滞和衰老的两条主要途径。我们比较了空白对照组和药物撤除后3天和5天实验组中常规衰老标志物p21和p16的蛋白水平，结果显示，药物撤除后5天的衰老程度明显高于其他治疗组。Lamin B1是核细胞骨架蛋白的主要结构组分，参与调节许多核功能。Lamin B1的下调和丢失是细胞衰老的有力标志。与空白对照组相比，药物撤除后3天和5天的衰老细胞蛋白水平中Lamin B1下调和丢失（图1C）。细胞周期分为G1、S、G2和M相。衰老肿瘤细胞通常停滞在G2/M期，S期下降。另外，细胞周期分析显示，与空白对照组相比，多柔比星处理后的MCF7细胞周期的G0/G1期几乎没有变化，S期减少，G2/M期主要被阻断。在药物给药后的5天，细胞停滞最明显（图1D）。因此，在后续研究中，我们选择250 nM浓度的多柔比星处理MCF7细胞2小时，然后撤除药物5天作为模拟化疗诱导肿瘤细胞衰老的条件，并将接受此条件处理的MCF7细胞命名为MCF7-SE。

检测衰老细胞的第一个工具来自衰老细胞中高水平表达的溶酶体β-Gal，也称为衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal），是最广泛使用的细胞衰老标志物，被认为是识别衰老细胞的黄金标准。因此，我们通过光学显微镜比较了用该条件处理的MCF7-SE细胞的形态与正常乳腺癌细胞MCF7的形态，发现该细胞形态扁平、不规则、增大、多核和胞质内有空泡，细胞衰老SA-β-gal染色呈阳性，表现出衰老细胞的典型特征（图1E）。免疫荧光实验还显示，用该条件处理的MCF7-SE细胞的细胞核形态扭曲、外翻和内陷，Lamin B1的表达丧失，而空白对照组细胞的细胞核形态正常，Lamin B1的表达正常（图1F）。证明了250 nM浓度的多柔比星处理MCF7细胞2小时，然后撤除药物5天，能够诱导肿瘤细胞衰老。同时，由多柔比星诱导的衰老MCF7细胞被命名为MCF7-hSE，简称M7-SE。