冻融处理的脱细胞基质 (dECM) 在生物材料领域的应用：生物相容性、降解性和整合能力

2.4.1. 冻融处理的 dECM 对局部生物相容性、生物降解性和整合能力的影响

异物反应 (FBR) — 即异物巨细胞 (FBGCs) 和纤维化的形成，会限制植入物的功能甚至导致最终失败 [71, 72, 73]。将材料植入大鼠的皮下，并在植入后的 7、14 和 28 天进行组织学分析以评估异物反应（图 6A）。组织学染色显示 dECM 周围有一条炎症反应带，表明对生物材料的异物反应较轻（图 6B 和图 S12，支持信息）。在第 7 天，观察到少量的 FBGCs 在 dECM 与周围之间的界面上（图 6D）。三组之间的整合率没有显著差异（图 6E）。第 14 天，观察到较少的 FBGCs，且 F/T 3 的囊壁厚度最薄，表明局部组织中的异物反应较轻（图 6C，G）。炎症反应评分表明，这些 dECM 的生物相容性优于对照组（图 6F，表 S1，支持信息）。

F/T 3 的降解速率最慢，这可能部分地解释了其降解时间的延长，根据目前的认识，FBGCs 可以通过吞噬作用降解基于胶原蛋白的生物材料（图 6B）[74]。非交联的 dECM 通常在第 14 天开始解体，并在一个月内几乎完全降解，这与先前的结果一致 [74, 75]。胶原蛋白基生物材料的主要缺点是力学性能差和快速生物降解 [76]。冻融处理改善了 dECM 的降解同时改善了其力学性能。

2.4.2. 冻融处理的 dECM 调控巨噬细胞极化的能力

如前所述，通过调节 dECM 的力学特性可以调节巨噬细胞的极化 [62]。为了验证巨噬细胞对 dECM 的影响，对植入控制组、F/T 3 组和 F/T 7 组的大鼠背部皮肤进行了免疫组织化学染色，分别在第 7 天和第 14 天进行观察（图 7A 和 B）。结果显示，在所有三组中都观察到 CD68+ 巨噬细胞的浸润，主要 CD68+ 巨噬细胞分布在 dECM 和软组织的交界处（图 S14，支持信息）。免疫组织化学染色的定量分析表明，在第 7 天，F/T 3 组平滑表面上的 M1 巨噬细胞 (iNOS+) 较少，而在第 7 天和第 14 天，F/T 3 组的 M2 巨噬细胞 (CD163+ 和/或 CD206+) 较多，与对照组相比 [8]。

通过反转录-定量聚合酶链式反应 (RT-qPCR)，验证了 dECM 诱导巨噬细胞极化的能力（图 7E）。将 dECM 与巨噬细胞共培养 24 小时后，与对照组相比，F/T 7 组的 dECM 显著降低了 M1 型巨噬细胞标记基因 CD86、CD11c 和 TNFα 的表达，而 F/T 3 组的 dECM 显著提高了 M2 型巨噬细胞标记基因 CD163、CD206 和 ARG 的表达。这些结果验证了在体内观察到的 F/T 3 可以诱导抗炎巨噬细胞表型。因此，可以推断冻融处理可能赋予 dECM 诱导 M2 型巨噬细胞极化的能力。

2.5. 冻融处理的 dECM 加速大鼠创伤愈合

为了评估创伤愈合的进程，将控制组、F/T 3 组和 F/T 7 组的 dECM 支架植入斯普鲁格－道利 (SD) 大鼠创伤愈合模型（图 8A）。根据宏观创口闭合情况评估创伤愈合速度（图 8B 和 C）。相对创伤面积的定量分析表明，与对照组相比，冻融处理的 dECM 在全厚度皮肤再生中具有显著的效果，其中 F/T 3 组的创伤闭合率最高（图 8D）。

第 5 天，dECM 与正常组织之间的界限明显，上皮舌附着在 dECM 上（图 8F）。第 10 天，F/T 3 组和 F/T 7 组的创伤完全上皮化，dECM 与正常组织融合。第 15 天，F/T 3 组的创伤几乎愈合，真皮层再生，皮肤中发育出新生毛囊。相比之下，对照组和 F/T 7 组中观察到的新生毛囊和腺体较少。F/T 3 组的缝隙宽度显著较短，可能是由于抗炎微环境（图 8E）[77, 78, 79]。特别是，大鼠皮肤的固有创伤收缩只能促进表皮闭合，而不利于真皮的成熟，这表明这些新生组织得益于冻融处理的 dECM [77]。此外，马尔维辛三色染色在第 15 天进行，以进一步区分 dECM 与再生组织（图 8G）。值得注意的是，dECM 并未完全降解，位于再生组织下方，说明经过三次冻融循环处理的 dECM 能够促进软组织再生，而不仅仅是作为一个创伤敷料。此外，还在 SD 大鼠 20mm 创伤模型中评估了带或不带 dECM 的 F/T 3 组的创伤愈合速度，结果显示 dECM 确实促进了早期创伤闭合（图 S15，支持信息）。遗憾的是，硅胶环在三天内破裂，没有 dECM 的创伤显示明显的收缩，导致闭合速度更快。

与其他组的 dECM 相比，经过三次冻融循环处理的 dECM 在宏观尺度上具有更高的抗拉模量，约为 6 MPa。与此同时，其在微尺度上的抗拉模量仍然是三个测试组中最高的，达到约 0.4 MPa 的水平。此外，F/T 3 的纳米力学性能约为 1 MPa，与 F/T 7 相当。近年来，越来越多的证据表明，将生物材料的力学性能调整至与目标组织相匹配是有益的 [80, 81]。考虑到大鼠背部皮肤的抗拉模量约为 1-10 MPa [82, 83]，F/T 3 dECM 具有最相似的抗拉模量，因此被发现能促进最佳的生物学结果，这并不令人意外。

此外，我们进行了免疫荧光染色以研究冻融处理的 dECM 诱导的巨噬细胞极化状态在创伤愈合中的作用（图 9A）。第 5 天，F/T 3 组和 F/T 7 组中 CD68+iNOS+ 细胞的数量显著低于对照组，而 F/T 3 组中 CD68+CD206+ 细胞的数量更高，表明 F/T 3 组中的 dECM 促进了 M2 而不是 M1 极化（图 9B）。这些结果与之前关于大鼠皮下模型中巨噬细胞极化的研究结果一致，表明冻融处理的 dECM 对创伤愈合过程中的巨噬细胞极化具有显著的免疫调节作用。

总之，通过冻融处理成功地制备了一种保留天然三维生物结构的机械可调 dECM。冻融处理的 dECM 的结构和力学性能在多个长度尺度上得到改变，赋予其良好的生物相容性、生物降解性和调节巨噬细胞极化的能力。特别是，巨噬细胞在 dECM 上的粘附行为可能是调节巨噬细胞极化的关键事件。最后，通过冻融处理调节 dECM 的弹性模量，在体内增强了创伤愈合（方案 1）。

理解 dECM 从分子（纳米和微观力学性能）到器官水平（宏观力学性能）的力学性能，对于设计生物材料的力学特性至关重要。需要注意的是，虽然本研究使用抗拉模量来代表 dECM 的宏观力学性能，但拉伸测试无法完全模拟 dECM 的临床应用。dECM 的微观力学性能的表征值得进一步考虑。此外，机械线索的免疫调节机制尚未得到很好的解释。对机械转导的深入理解需要进一步的实验验证，例如机械线索对细胞粘附行为的影响。