冻融处理赋予去细胞基质（dECM）多尺度力学性能的可调性及生物相容性

去细胞化的目标是在最大程度保留ECM蛋白质和原始基质结构的同时，高效地去除细胞。组织学染色dECM（对照组、F/T 3组和F/T 7组）证实了有效的去细胞化，无可见细胞核（图1C）。所有三个组（对照组、F/T 3组和F/T 7组）的DNA含量定量结果显示无显著差异，并且所有三个组的dECM的DNA含量均满足文献中建议的每毫克干重低于50ng的标准（图1G）。剩余的多孔结构可以促进细胞穿透、迁移、营养物质的运输和代谢物的排除[33]。考虑到暴露胶原纤维二级构象会引起严重的不良免疫反应，我们进一步使用差示扫描量热术（DSC）、衰减全反射傅里叶变换红外（ATR-FTIR）、能量色散光谱（EDS）和X射线衍射（XRD）来进一步确认胶原的结构完整性[34]。热峰与胶原从三股螺旋结构向无规卷曲结构的转变有关，峰值对应于变性温度（Td）[35]。胶原稳定的三股螺旋结构通常由多肽（Pro-Hyp-Gly）10形成，并通过链间氢键促进，其Td的典型范围为60°C至90°C[35,36]。在我们的研究中，我们观察到F/T 3组中的Td峰值为80.3°C，对照组为77.7°C（图1D）。这表明存在更多负责稳定胶原三股螺旋的氢键。因此，DCS测试中峰值的移动通常被接受为原始三股螺旋结构完整性的指标[37,38]。在傅立叶变换红外光谱中，3500cm-1（酰胺A）处的宽带与NH2键合有关，1647cm-1（酰胺I）处的峰与羰基伸缩振动有关，1550cm-1（酰胺II）处的峰与NH变形和CN伸缩振动有关，1241cm-1（酰胺III）处的峰与CN伸缩振动和NH弯曲振动有关。这些峰是胶原三股螺旋结构的最显著特征[30]。作为肽构象的敏感标志物，这些特征峰在三个组的光谱中都有观察到（图1E），表明去细胞化方法没有损坏胶原的二级结构[39]。此外，EDS图确认了C、N、O、Na、Mg、Al、P和S元素的存在和均匀分布，EDS光谱显示了三个组中元素含量的相似性（图S4，支持信息）。如图1F所示，所有三个组的dECM显示了与胶原三股螺旋相关的7°–8°处的峰以及与纤维网络引起的扩散反射相关的20°处的宽峰[40,41]。此外，所有组都表现出较高的吸水能力和中性pH（图S5A、B，支持信息）。值得注意的是，SDS-PAGE分析表明，在整个冻融处理过程中，dECM的成分基本保持不变（图S5C，支持信息）。\n\n良好的生物相容性是组织工程生物材料的先决条件。在本研究中，RAW 264.7巨噬细胞和成纤维细胞分别植入到dECM上，并进行CCK-8测定评估细胞增殖。与对照组相比，F/T 3组和F/T 7组的细胞活力在第3天显著增加（图1H）。冻融处理可以通过形成细胞内冰晶并引起细胞裂解有效去除细胞组成并减少异物反应，但过度使用冻融处理可能导致结构损伤并暴露胶原纤维二级构象引起严重的不良免疫反应[34]。三次冻融循环可能足以去除细胞，同时最大程度地保留ECM蛋白质和原始基质结构，以我们的去细胞化方案。此外，使用大鼠皮下模型评估了dECM的系统毒性。将同一组的四个10 mm × 10 mm的正方形dECM植入，所有大鼠保持健康。在整个研究过程中未观察到任何并发症，如感染、切口裂开或延迟创面愈合。考虑到dECM在一个月内完全降解，于第28天检查了重要器官的健康状况。在任何三个组的主要器官中都未观察到病变（图S6，支持信息）。由于保留了dECM的原始3D生物结构和生物活性成分，dECM衍生的生物材料表现出良好的生物相容性[6]。\n\n通过使用主要降解胶原I和III型的胶原酶MMP-1，我们研究了dECM的体外降解性。在48小时内，对照组中超过90%的dECM已经降解，而F/T 3组中仍有20%的dECM未溶解（图1I）。这说明冻融处理可以延长dECM的细胞外降解行为。\n\n这些结果表明，所有三个组的dECM都是无细胞的，保持了胶原的构象和结构，并具有良好的生物相容性和可降解性。与以前的研究一致，ECM的超微结构在冻融处理过程中相对保持较好[32,43]。这可能创造了一个有利于3D结构组织生长的细胞微环境，进一步提高了生物相容性[44]。\n\n2.2. 冻融处理赋予dECM多尺度力学性能的可调性\n\ndECM在多个长度尺度上的力学性能对其临床表现至关重要，因为力学信号塑造了我们对生物材料的组织反应[31]。生物材料的宏观力学性能决定其工作特性和与器官或组织的相互作用，而微观尺度的力学性能指导细胞反应，纳米尺度的力学性能影响原位分子相互作用[45]。