Western Blot 检测 RKO 细胞蛋白表达量：详细操作步骤

以下是使用冻存 RKO 细胞制备样品用于 Western blotting 检测某一蛋白表达量的步骤：\n\n1. 培养 RKO 细胞：使用培养基（如 DMEM）将 RKO 细胞培养至合适的密度。注意，细胞应处于对照组和处理组中。\n\n2. 收集细胞：用无菌 PBS 洗涤细胞，然后用胰蛋白酶等酶解液将细胞从培养板上收集下来。将细胞转移到离心管中。\n\n3. 离心：将细胞离心以去除培养基和酶解液。将上清液去除，留下细胞沉淀。\n\n4. 冻存细胞：根据冻存液的配方，向细胞沉淀中加入合适的冻存液，并轻轻混匀。将细胞冻存液均匀地分装到冻存管中。\n\n5. 冻存：将分装好的细胞冻存液放入 -80℃ 的冰箱中冷冻。在冷冻过程中，细胞将逐渐冷冻并保存。\n\n6. 解冻细胞：当需要使用样品时，将冻存管从 -80℃ 的冰箱中取出，并立即将其放入 37℃ 的水浴中解冻。解冻后，立即将细胞沉淀转移到无菌离心管中。\n\n7. 离心：将细胞离心以去除冻存液。将上清液去除，留下细胞沉淀。\n\n8. 裂解细胞：向细胞沉淀中加入细胞裂解液（如 RIPA 缓冲液）并轻轻混合。将细胞裂解液在冰上孵育一定时间，使细胞完全裂解。\n\n9. 离心：将细胞裂解液离心以去除细胞碎片和细胞核等残留物。将上清液（蛋白提取液）转移到新的离心管中。\n\n10. 蛋白浓度测定：使用蛋白浓度检测试剂盒（如 BCA 法）测定蛋白提取液中的蛋白浓度。\n\n11. SDS-PAGE 凝胶电泳：根据需要的蛋白分子量，将蛋白提取液中的蛋白进行 SDS-PAGE 凝胶电泳分离。\n\n12. 转膜：将分离好的蛋白转移到 PVDF 或 NC 膜上。\n\n13. 阻断：将转膜的蛋白用 5% 脱脂奶粉或 3% BSA 等阻断液进行阻断，以减少非特异性结合。\n\n14. 一次抗体孵育：将特异性一抗加入阻断液中，与目标蛋白结合。在 4℃ 下孵育一夜。\n\n15. 洗涤：用 TBST 洗涤膜上未结合的一次抗体。\n\n16. 二次抗体孵育：将特异性二抗加入阻断液中，与一抗结合。在室温下孵育 1-2 小时。\n\n17. 洗涤：用 TBST 洗涤膜上未结合的二次抗体。\n\n18. 显色：使用 ECL 或其他适当的显色试剂对蛋白进行可视化。\n\n19. 成像：使用化学发光成像系统对蛋白条带进行成像和记录。\n\n通过以上步骤，您可以使用冻存的 RKO 细胞制备样品进行 Western blotting 检测某一蛋白的表达量。