Western Blotting 使用冻存 RKO 细胞检测蛋白表达量 - 详细步骤指南

冻存 RKO 细胞制备样品用于 western blotting 检测某一蛋白的表达量的步骤如下:\u000a\u000a1. 培养 RKO 细胞：将 RKO 细胞培养在含有适当培养基和补充物的培养皿中，保持在 37°C 的细胞培养箱中，含有 5% CO2。\u000a\u000a2. 增殖至适当密度：培养 RKO 细胞至适当的细胞密度，一般为 80-90% 的密度。\u000a\u000a3. 收集细胞：用 PBS 洗涤细胞，将细胞转移到离心管中，并以 1000 rpm 离心 5 分钟。\u000a\u000a4. 移除上清液：将上清液完全移除，然后加入适量的 PBS 悬浮细胞，并轻轻混匀。\u000a\u000a5. 冻存细胞：将细胞悬浮液分装入冻存管中，然后将其置于 -80°C 的冷冻柜中冷冻保存。\u000a\u000a6. 解冻细胞：从冷冻柜中取出冻存管，迅速将其放入 37°C 的水浴中，直到细胞完全解冻。\u000a\u000a7. 破碎细胞：用细胞裂解缓冲液（如 RIPA 缓冲液）裂解细胞，使细胞膜完全破裂，并释放出细胞内的蛋白。\u000a\u000a8. 离心：用高速离心将裂解的细胞碎片离心，以去除细胞碎片和细胞核等残留物。\u000a\u000a9. 蛋白浓度测定：使用蛋白质浓度测定试剂盒，根据说明书测定蛋白的浓度。\u000a\u000a10. SDS-PAGE 电泳：根据蛋白质浓度，在 SDS-PAGE 凝胶中加载相同浓度的蛋白样品，并进行电泳分离。\u000a\u000a11. 转移电泳：将电泳分离后的蛋白转移到 PVDF 或 nitrocellulose 膜上。\u000a\u000a12. 阻断：用蛋白阻断剂（如 5% 脱脂奶粉或 3% BSA）在室温下阻断膜上的非特异性结合位点。\u000a\u000a13. 主抗体孵育：将特异性的一抗主抗体加入到含有蛋白阻断剂的洗涤缓冲液中，然后在膜上孵育过夜。\u000a\u000a14. 洗涤：用洗涤缓冲液洗涤膜上的未结合主抗体。\u000a\u000a15. 二抗孵育：加入 HRP 标记的二抗（如抗兔 IgG-HRP 或抗鼠 IgG-HRP）到洗涤缓冲液中，然后在膜上孵育 1-2 小时。\u000a\u000a16. 洗涤：用洗涤缓冲液彻底洗涤膜上的未结合二抗。\u000a\u000a17. 显色：使用适当的显色剂（如 ECL）进行显色。\u000a\u000a18. 成像：用相应的成像系统（如 chemiluminescence 成像系统）拍摄图像。\u000a\u000a这些步骤将帮助您制备冻存 RKO 细胞样品，并用于 western blotting 检测某一蛋白的表达量。