BPA处理胚胎细胞的DNA损伤检测方法 - 彗星试验

为确定BPA处理的胚胎细胞中是否发生了DNA损伤，进行了碱性单细胞凝胶电泳（SCGE，也称彗星试验），方法参考Speit等人（Speit和Rothfuss，2012）。简而言之，暴露于BPA 96小时的胚胎经胰酶和II型胶原酶消化，通过200过滤器筛选，然后用PBS稀释以获得单个细胞悬液。将载玻片覆盖一层0.5%正常熔点琼脂（NMA，56℃），混合5 mL细胞（含约1000个细胞）和75 mL 0.5%低熔点琼脂（LMA，37℃）作为第二层涂覆在载玻片上。然后，覆盖85 mL无细胞的0.5%低熔点琼脂作为第三层。每层都覆盖玻片，当琼脂在4℃凝固后将玻片去除。将载玻片浸泡在冷脱氧核糖核酸（DNA）裂解液（2.5 M NaCl，100 mM Na2EDTA，10 mM Tris，1%十二烷基硫酸钠，pH 10，1% Triton-X-100，10% DMSO）中过夜，在4℃下洗涤三次。将载玻片在碱性溶液（1 mM Na2EDTA，300 mM NaOH，pH 13）中孵育30分钟，然后进行25 V和300 mA的电泳20分钟。电泳后，将载玻片在0.4 M Tris-HCL（pH 7.5）中中和15分钟，然后用30 mg/mL红色荧光核酸染料（solarbio，中国）染色20分钟。荧光图像在荧光显微镜（Eclipse 50i，尼康，日本）下以400倍放大率捕获。对于每种处理，随机选择100个彗星进行分析。通过CASP 1.2.3（彗星试验软件程序，CASPLab）计算尾长、彗星尾部DNA百分比、尾部矩（[尾部中DNA的百分比] × [尾长]）和OliveTailMoment（[尾部中DNA的百分比] × [DNA重心在x方向的尾部重心与头部重心之间的距离]）。