佛罗里达长尾鱼基因组揭示脊索动物进化中的基因组扩增事件

本文描述了佛罗里达长尾鱼'Branchiostoma floridae'的高度多态性约520兆碱基基因组结构和基因内容，并从脊索动物进化的角度对其进行了分析。通过全基因组比较，揭示了三个脊索动物类群（被囊动物、长尾鱼和脊椎动物）之间复杂的关系，不仅可以重建最后一个共同脊索动物祖先的基因组组成，还可以部分重建其基因组组织，并描述脊椎动物谱系中两次基因组范围的扩增和随后的重组。这些基因组范围的事件塑造了脊椎动物基因组，并为脊椎动物进化提供了额外的遗传变异。

长尾鱼，也称文昌鱼，是一种体型小的蠕虫状海洋动物，大部分时间都埋在海底，通过无颌、有纤毛的嘴巴进行滤食。早在19世纪初，人们就注意到这些不起眼的生物与脊椎动物的亲缘关系1,2，之后胚胎学家亚历山大·科瓦列夫斯基3进一步证实了这一点。特别是，科瓦列夫斯基观察到，与其他无脊椎动物不同，文昌鱼与脊椎动物和被囊动物（也称为尾索动物）共享关键的解剖学和发育特征。这些特征包括空心的背侧神经管、脊索、穿孔的咽部区域、分节的体肌（胚胎学上源自体节）和肛门后的尾部。脊椎动物、尾索动物和长尾鱼（也称为头索动物）共同构成了脊索动物门，它们起源于一个大约5.5亿年前的最后一个共同祖先。

尽管科瓦列夫斯基、达尔文等人认识到脊索动物类群之间的进化关系，但脊椎动物在形态学、生理学和神经复杂性方面的优势提出了一个难题：脊索动物的祖先——可能是一种类似于现代文昌鱼或海鞘幼虫的简单生物——是如何完成如此巨大的转变的？

关于脊椎动物复杂性起源最普遍的假设是建立在Susumu Ohno (1970)4的思想基础上的，他提出脊椎动物基因组是由一系列古老的基因组范围扩增事件塑造的。在Ohno最初的提议中，长尾鱼和脊椎动物的基因组相对于基本无脊椎动物基因组而言，通过一到两轮基因组倍增而扩大，然而随后的研究表明，这些事件发生在长尾鱼谱系分化之后脊椎动物的祖先分支上5,6。

尽管对人类和其他脊椎动物基因组的测序已经表明，脊椎动物的基因数量与无脊椎动物相当，或者仅仅略多于无脊椎动物7,8，但关于脊椎动物祖先分支上大规模片段或全基因组复制的证据不断增多，同时人们也意识到，来自此类事件的大多数基因复制体很快就会消失（见文献9）。从脊椎动物祖先分支上保存下来的相对较少的基因复制体为人类染色体组之间的古代旁系同源关系提供了证据10,11,12,13,14，这些关系很可能是由现代脊椎动物出现之前多轮全基因组复制产生的。然而，复制事件的数量、时间甚至基因组范围，以及它们对随后基因组进化的影响，目前尚不清楚（见文献15的综述），部分原因是与未复制的早期脊索动物核型相比，被囊动物的基因组高度重排（见下文）。

佛罗里达长尾鱼'B. floridae'（属名'Branchiostoma'指的是其特征性的穿孔鳃弓）为这些研究提供了重要的参考点16。该物种及其近缘物种（统称为文昌鱼，源于希腊语'amphi+oxys'，意为“两端尖锐”）被广泛认为是脊索动物祖先的现存代表，部分原因是现代文昌鱼与寒武纪早期澄江生物群中假定的脊索动物化石（'Yunnanozoon lividum'17，以及类似的'Haikouella lanceolatum'18）和中寒武世伯吉斯页岩（'Pikaia gracilens'19）具有相似性，尽管仍存在争议（例如，见文献20,21）。对文昌鱼中关键发育基因的研究揭示了脑、肾脏、胰腺和垂体等脊椎动物器官的进化，以及早期胚胎模式形成的遗传机制（见文献22–24的综述）。文昌鱼在Hox基因簇25研究、特定基因组区域26,27,28研究以及作为众多基因家族研究的外部参照群29等方面，一直充当着原始脊椎动物祖先的基因组替代物。

我们报告了佛罗里达长尾鱼的基因组草图序列，并将其结构与其他动物的基因组进行了比较。对基因序列和外显子-内含子结构进行的稳健系统发育分析证实了最近的提议，即被囊动物是脊椎动物的姊妹群，长尾鱼是最基础的脊索动物亚门，而棘皮动物-半索动物组合支系是脊索动物的姊妹群。通过比较分析，我们确定了17个祖先脊索动物连锁群，这些连锁群在现代文昌鱼和脊椎动物基因组中得以保留，尽管它们在超过5亿年的独立进化过程中已经发生了变化。超过90%的人类基因组包含在这些连锁群中，这些连锁群显示出明显的四倍冗余，这与脊椎动物祖先分支上的全基因组四倍化一致。与海鞘、七鳃鳗、象鼻鲨和几种硬骨鱼的序列进行比较，将全基因组事件的发生时间限定在脊椎动物与被囊动物和长尾鱼分化之后，但发生在软骨鱼和硬骨鱼分化之前。在我们的分析分辨率范围内，我们发现有证据表明，在无颌脊椎动物（例如七鳃鳗）和有颌脊椎动物分化之前和之后都发生过基因组复制，尽管无颌脊椎动物和有颌脊椎动物分化过程中发生的八倍体时期仍然是一个可能性。虽然这些全基因组事件中大多数复制基因都丢失了，但参与发育过程的基因却不成比例地保留了下来。

基因组序列

我们使用全基因组鸟枪法30对约520兆碱基（Mb）的文昌鱼基因组进行了测序，该方法使用了来自不同插入片段大小的随机剪切文库的约11.5倍冗余配对末端序列覆盖率（补充说明2）。基因组DNA是从2003年7月从佛罗里达州坦帕湾采集的一只成年雄性个体的性腺中提取的，并表现出广泛的等位基因变异（3.7%的单核苷酸多态性，加上6.8%的多态性插入/缺失；补充说明4）。这是在任何单个生物体中报道的最高水平的序列变异，超过了紫色海胆31中发现的变异水平。组装版本1分别报告了两种单倍型，而在组装版本2中，每个位点选择了一种单倍型（补充图63）。组装版本2跨越522 Mb，其中一半的序列位于62个长度超过2.6 Mb的支架中。

目前还没有文昌鱼的物理或遗传图谱，因此我们无法将其重建为其19对染色体32。然而，由于一半的预测基因包含在包含138个或更多基因的支架中，因此当前的基因组草图组装具有足够的长程性，可以进行有用的保守同线性分析，与其他物种进行比较，如下所示。将组装后的序列与从表达序列标签（EST，见下文）推导出的开放阅读框进行比较表明，该组装捕获了超过95%的已知蛋白质编码内容，与已完成的克隆序列进行比较证明了该组装的碱基水平和长程准确性（补充说明2）。

蛋白质编码基因和转座因子

我们估计，单倍体文昌鱼基因组包含21,900个蛋白质编码位点。该基因组采用标准方法进行了建模，这些方法针对文昌鱼进行了调整，将同源性和从头基因预测方法与来自多种发育阶段的480,000多个ESTs相结合24（补充说明3）。大约三分之二的蛋白质编码位点（15,123个）在两种单倍型中都被捕获。转座因子约占文昌鱼基因组组装的30%（补充表5），属于500多个家族。根据它们对基因组大小的整体贡献，DNA转座子比逆转录转座子丰富两倍。

多态性

在短距离尺度上观察到的局部杂合性分布遵循几何分布（补充图1），这与随机交配模型的预测一致，正如在'Ciona savignyi'33中观察到的那样，群体突变率为4μNe = 0.0562，其中μ是每代突变率，Ne是有效群体大小。高杂合性原则上可以解释为：(1) 多代以来维持的大规模有效群体大小，(2) 每代突变率高，或 (3) 以前隔离的群体最近混合；在后一种情况下，局部杂合性的几何分布将不会出现。假设典型的后生动物突变率约为每代每千兆碱基（Gb）一到十个替换34,35，观察到的等位基因之间的杂合性表明，有效繁殖群体规模巨大，但合乎情理，约为数百万个体。观察到的杂合性在短距离内显示出相关性，这些相关性在超过约1 kb的尺度上衰减，表明该群体中存在广泛的重组（补充图2）。对非同义替换与同义替换比率Ka/Ks的分析显示，纯化选择的证据与哺乳动物物种之间发现的证据相当（补充说明4）。插入/缺失多态性很常见，正如在其他种内和种间基因组比较中发现的那样36（补充图3）。单倍型之间的结构变异还包括局部倒置和串联重复（补充图63）。

后口动物关系

有了文昌鱼基因组草图序列，我们重新审视了脊索动物内部以及后口动物门（脊索动物、棘皮动物和半索动物）之间的关系。传统上将长尾鱼置于脊椎动物的姊妹群位置，将被囊动物置于最早分化的脊索动物亚门位置，最近受到了质疑37,38。一项初步研究39使用146个基因位点（33,600个比对的氨基酸位点）以及来自当前文昌鱼基因组项目的痕量数据，支持被囊动物作为脊椎动物的姊妹群。然而，这项分析也表明（尽管统计支持有限），文昌鱼与棘皮动物的关系比与被囊动物或脊椎动物的关系更密切，这将使脊索动物成为一个并系群。另一项研究使用类似大小的基因集，但包含更多样的后口动物分类群，支持头索动物谱系的早期分化，但没有支持文昌鱼与棘皮动物的密切关系40。

为了解决文昌鱼有争议的系统发育位置，我们分析了一组更大的1,090个直系同源基因（见补充说明5）。贝叶斯和最大似然方法都支持新的脊索动物系统发育38,39,40，其中头索动物代表现存最基础的脊索动物谱系，被囊动物（在我们的分析中以'Ciona intestinalis'和'Oikopleura dioica'为代表）是脊椎动物的姊妹群，但其长分支表明氨基酸替换水平更高（图1）。单个基因树也为这种拓扑结构提供了支持；支持被囊动物作为脊椎动物姊妹群的基因数量是支持文昌鱼位于此位置的基因数量的两倍。对后口动物中内含子获得和丢失的分析为长尾鱼作为现存最基础的脊索动物亚门提供了独立的支持（见下文）。正如文献41中所述，我们将棘皮动物（即紫色海胆）和半索动物（即海鞘虫）归为一组（腕足动物），作为单系脊索动物支系的姊妹群，这与文献39中的建议相反。除了长分支的被囊动物之外，最大似然树表明，在整个后口动物树中，肽变化的进化速率大致恒定，尽管与简单的分子钟模型的预测相比，脊椎动物中的替换数量过多。