吡啶酮衍生物：一种新型腺苷 A2A 受体拮抗剂用于癌症免疫治疗

本文研究了吡啶酮衍生物作为有效的、选择性的和口服生物可利用的 Adenosine 2A 受体拮抗剂在癌症免疫治疗中的应用。通过室内化合物文库筛选，确定了一个具有弱 A2AR 拮抗活性的吡啶酮组合物（1）。进一步的构效关系研究揭示了一系列具有强效能的吡啶酮衍生物。化合物 38 具有有效的 A2AR 拮抗活性（IC50 = 29.0 nM），良好的小鼠肝微粒体代谢稳定性（t1/2 = 86.1 min）和优异的口服生物利用度（F = 86.1%）。值得注意的是，38 通过下调免疫抑制分子（LAG-3 和 TIM-3）和上调效应分子（GZMB，IFNG 和 IL-2）有效地增强了体外 T 细胞的活化和杀伤能力。此外，38 通过口服给药在 MC38 肿瘤模型中表现出优异的体内抗肿瘤活性，其肿瘤生长抑制率（tGI）为 56.0%，表明其作为新型 A2a R 拮抗剂候选癌症免疫治疗的潜力。

近年来，研究和临床证据有力地支持了腺苷 A2A 受体拮抗剂作为治疗癌症免疫治疗的新方法的发展。腺苷作为胞外三磷酸腺苷 (ATP) 水解的产物，在人体内广泛分布。Adenosine 作为内源性配体，通过激活特异性 G 蛋白偶联受体 (gPCR) 发挥多种功能，包括细胞生长、心律、免疫功能、睡眠调节和血管生成1-3。Adenosine 受体分为四个亚型，即腺苷 A1 受体 (A1R)、腺苷 A2 受体 (A2AR)、腺苷 A2B 受体 (A2BR) 及腺苷 A3 受体 (A3R)。A1R 和 A3R 亚型能够激活 Gi 蛋白，而 A2aR 和 A2bR 的活性是由腺苷酸环化酶激活并增加细胞内环腺苷酸 (cAMP) 浓度的 Gs 蛋白介导的。在所有亚型中，A2AR 作为抗炎性疾病、神经退行性疾病等多种疾病的潜在药物靶点受到广泛研究和关注。

帕金森病 (PD) 是 A2A 受体拮抗剂的关键指标之一。尽管 PD 的治疗主要是使用多巴胺替代疗法和多巴胺能药物的症状治疗 60 多年，但包括恶心，呕吐和低血压在内的 6 种副作用对其在疾病治疗中的使用施加了某些限制。因此，人们开展了大量的研究来探索非多巴胺能途径，其中 2023 年美国化学学会 A2AR 途径受到了广泛的关注。最成功的例子之一是 istradefylline (KW-6002，图 1)，一种 A2AR 拮抗剂，已经在美国和日本成功销售。然而，这种药物在改善运动症状和生活质量方面不如左旋多巴。为了达到更好的症状控制，这些非多巴胺能药物作为辅助治疗与左旋多巴治疗帕金森病。耐受性问题也是研制抗 PD 的 A2AR 拮抗剂的一个重要挑战。因此，A2A R 拮抗剂治疗帕金森病仍有进一步发展的空间。

最近，腺苷在肿瘤进展中的作用已经被认识到，并且 A2A R 拮抗剂已经被确定为癌症免疫治疗中的下一代免疫检查点抑制剂之一。细胞死亡和缺氧都导致细胞外 ATP 的大量释放。在肿瘤微环境 (TME) 中，缺氧通过缺氧诱导的肿瘤从免疫系统的攻击上调 CD39 和 CD73 的表达。腺苷 via A2aR 产生的免疫抑制反应包括：抑制 CD8+ T 细胞的细胞毒性，抑制自然杀伤 (NK) 细胞的细胞毒性，增强调节性 T 细胞 (Treg) 的免疫抑制活性，增加 Treg 细胞的增殖等。15,16 几种 A2A R 拮抗剂目前正在进行癌症治疗的临床试验，例如 ciforadant (CPI-444)，inupaden-ant (EOS-100850)，AZD-4635，PBF-509 和 PBF-999 (图 1)。然而，一些最初用于治疗 PD 的临床化合物在与癌症相关的临床试验中表现出较差的疗效 [17,18]，可能是由于 TME 中腺苷浓度显着增加。一般情况下，TME 中腺苷的浓度可达微摩尔水平 (比正常浓度高 10 ~ 100 倍)，高于 PD 的病理状态。这可能是为什么一些原来用于治疗 PD 的临床化合物在肿瘤免疫治疗中失去了一些效果的原因。

因此，目前仍然需要具有新型支架和高效力的 A2A 拮抗剂在高海登苷环境中。外核苷酸酶 CD39 和 CD73 在肿瘤表面的表达增加了腺苷的产生。因此，一种基于腺苷受体和其他重要靶点的联合治疗方法最近被开发出来。此外，A2AR 拮抗剂与其他免疫检查点抑制剂的联合应用也成为研究的热点。21 研究表明，用 CPI-444 阻断 A2AR 可减少 T-effs 和 Tregs 中各种途径检查点的表达，包括 PD-1 和 LAG-3。22 也就是说，与 CPI-444 和 PD-1 单克隆抗体的组合存在协同反应。

我们之前报道过 2-氨基蝶呤 -7(8H)- 一种衍生物作为有效的腺苷 A2aR 拮抗剂，在模拟 NECA 的 1μM 高浓度下保持良好的活性。但是，蝶呤酮类化合物的药代动力学 (PK) 谱并不令人满意。在这项工作中，我们通过使用 GloSensor cAMP Assay (HEK293 细胞) 进行内部化合物文库筛选，确定了吡啶酮化合物 1 作为 A2A R 拮抗剂 (对 A2A R@10μM 的 35.3% 抑制) 的命中。用苯取代甲基呋喃环产生苯基衍生物 2，其显示对 A2A R 的抑制活性增加 (65.0% 抑制@10μM 和 IC50 为 3907 ± 777.6 nM，表 1) 和对 A2A R 相对于其他亚型的选择性 (IC50s 对 A2B R，A1 R 和 A3 R > 10μM，图 S1)。进一步的结构-活性关系 (SAR) 研究 2 揭示了一系列吡啶酮衍生物 (图 2) 作为新的有效和选择性的 A2A 拮抗剂。对所选化合物在小鼠肝微粒体 (MLM) 和体内 PK 谱中的代谢稳定性进行了测试。进一步评价了该关键化合物在体内外增强 T 细胞介导的肿瘤杀伤能力。

结果及讨论 化学。通过钯催化，将相应的芳基硼酸松油酯 (1a-14a) 与 2-氨基 -4,6-二氯吡啶亚胺偶联，得到单取代中间体 1b-14b。接下来，1b-14b 与 2-甲氧基 -4-吡啶硼酸匹那醇酯偶联产生中间体 1c-14c。1c-14c 在含 48% 氢溴酸的水溶液中回流 6 小时以除去甲基。脱甲基后，溶液在室温下冷却，用氢氧化钠水溶液中和，直到 pH 值调整到 8-9，得到 1 天 -14 天的白色沉淀。然后，1d-14d 用溴化苄进行亲核取代反应，得到目标化合物 1-14 (方案 1)。

化合物 15 和 19 的合成路线与化合物 11 的合成路线相似 (方案 2)。不同之处在于选择反应步骤 d、相应的溴乙苯和溴代环己烷进行 11d 的取代反应。另外，中间体 11b 与 2-甲氧基 -5-吡啶硼酸匹那醇酯偶联得到偶联产物 16c。经过类似的去甲基化步骤和 48% 的水溶液氢溴酸，然后用氢氧化钠水溶液碱化，中间 16d 以固体的形式沉淀。然后，所得到的中间体 16d 与相应的溴化底物进行亲核取代，得到目标化合物 16-18 (方案 2)。

参照化合物 11 (方案 3) 合成了化合物 20-41。在步骤 d 中，用不同的溴化底物进行取代反应，得到目标化合物。化合物 36 通过氢氧化锂一水合物水解得到。化合物 39 和化合物 41 分别由 38 和 40 经氟化得到。

化合物 42 和 43 的合成可参考化合物 38 的合成方法，以相应的 5-氟或 5-甲基取代的 2-氨基 -4,6-二氯嘧啶衍生物为起始原料。化合物 44 的合成是基于中间体 11b，它首先在嘧啶环的 5 位被 N-碘代琥珀酰亚胺 (NIS) 碘化。然后，由于不同的不反应性，吡啶皮那醇酯在 5 位优先与碘偶联，得到中间体 44d。以下路线可参考化合物 38 的合成方法 (方案 4)。

合成孔径雷达探测。如文献所述，化合物 1 中的左侧 (LHS) 甲基呋喃环似乎是 A2A R 拮抗剂常见的结构部分。然而，由于反应性环氧化合物或顺式中间体的产生，可能会对生物大分子产生潜在的毒性作用。因此，我们首先尝试去除甲基呋喃环，并设计了苯基衍生物 2。结果表明，化合物 2 对 A2A R 的抑制率 (10μM 浓度下的 65.0% 抑制) 高于化合物 1 (表 1)