真藓原生质体制备详细步骤及注意事项

2.2.4 真藓原生质体制备

(1) 使用121℃高温高压灭菌8% D-甘露醇溶液，冷却后备用。

(2) 将崩溃酶溶液加入4℃的原丝体材料中，2500 g离心5 min，上清液通过0.22 μm滤菌膜过滤到新灭菌的50 mL离心管中，以去除杂菌。

(3) 使用镊子夹取继代7天的原丝体材料，放入无菌的崩溃酶溶液中。

(4) 将含有原丝体材料的崩溃酶溶液放入室温下的摇床中，轻柔摇晃30 min（最长时间为1 h）。

(5) 使用150目和300目细胞筛过滤材料到小烧杯中。

(6) 将过滤后的溶液转移至新的50 mL圆底离心管中，盖好盖子，14℃下离心200g，使原生质体沉淀。

(7) 使用枪头吸去上清液，加入等体积的8% D-甘露醇溶液，轻轻混匀，再次离心200g，以去除杂质。

(8) 重复上一步骤。

(9) 使用显微镜和血球计数器计数计算需要加入MMM的体积，并检测原生质体的活性。