利用CRISPR/Cas9和TAR克隆技术揭示三种循环脂肽的抗微生物活性差异

芽孢杆菌通常分泌多种循环脂肽的混合物，包括'伊图林'、'表面活性素'和'普利帕斯塔丁'，直接区分每个循环脂肽的抗微生物活性很具挑战性。在这项研究中，利用CRISPR/Cas9构建了一个没有循环脂肽操纵子的B. subtilis 1A751 WR底盘菌株。利用转换相关重组(TAR)捕获B. amyloliquefaciens HYM-12的'伊图林'基因簇，并将其与sfp和degQ基因组装在一起。然后将其整合到底盘菌株中，获得了一个能够合成六种'伊图林'异构体的'伊图林'单产菌株。通过无疤痕基因敲入方法修复1A751 Δpps菌株的sfp基因中的移码，生成'表面活性素'单产菌株。抗微生物活性实验表明，'伊图林'、'表面活性素'和我们先前构建的'普利帕斯塔丁'单产菌株的提取物对致病细菌具有强烈的抑制作用。有趣的是，'伊图林'表现出显著的抗真菌活性，而'表面活性素'和'普利帕斯塔丁'表现出较弱的抗真菌活性。与卡那霉素、链霉素和氨苄青霉素相比，'伊图林'具有更强和持久的抗真菌活性。该研究证明TAR克隆对于克隆大基因簇很有效，证明了三种循环脂肽的抗微生物活性差异，并为进一步阐明它们的抗微生物机制奠定了理论基础。