嗅觉受体、重组细胞、试剂盒及其在食品变质检测中的应用

嗅觉受体、重组细胞、试剂盒及其用途

技术领域

本发明涉及嗅觉受体和气味剂，以及食品变质检测技术领域。

背景技术

食品变质过程中会产生多种特征挥发性化合物。目前国际上建立的感官分析方法对气味的反映相当主观，且无法定量，无法实现高通量检测。本发明提出了一种利用动物嗅觉受体评估食品品质的方法，可扩展为一项操作简便、高通量、灵敏的食品安全监测技术。

发明内容

本发明涉及一种嗅觉受体、重组细胞、试剂盒及其用途。嗅觉受体包括：OR2W1、MOR203-1、MOR261-1、MOR256-17、MOR244-3、hTAAR1、mTAAR1、mTAAR3、mTAAR4、mTAAR5、mTAAR7f，上述嗅觉受体用于检测食品变质。

本发明利用异源细胞表达嗅觉受体，利用双荧光素酶法测定嗅觉受体的活性。将嗅觉受体、Golf、CRE-Luciferase以及pRL-SV40的基因构建物用转染试剂Lipofectamine2000转染至HEK293T细胞中，用不同浓度梯度的化合物刺激细胞并孵育3-4小时。若嗅觉受体被激活，则细胞内cAMP浓度升高，cAMP将结合CRE-luciferase的启动子区，并促使荧光素酶的转录和翻译，因此荧光素酶的活性即可表征嗅觉受体的响应情况。

本发明最终确定了检测食物样品的嗅觉受体组合为OR2W1、MOR203-1、MOR261-1、MOR256-17、MOR244-3、hTAAR1、mTAAR1、mTAAR3、mTAAR4、mTAAR5、mTAAR7f。

为了实现对食物样品进行快速检测，我们首次尝试用实时发光技术检测食物样品对嗅觉受体的刺激情况。我们将嗅觉受体、Golf、pGloSensor-20F cAMP的基因构建物用转染试剂Lipofectamine2000转染至HEK293T细胞中，24小时后，气味分子激活嗅觉受体可以引起细胞内第二信使cAMP的增加。GloSensorTM cAMP Assay中使用的pGloSensor-20F cAMP基因构建物可预先表达一种荧光素酶变体，cAMP浓度升高可引起荧光素酶变体的构象变化，使得荧光素酶从无活性状态转变为活性状态，催化底物，产生发光信号，该方法可实时快速地测定cAMP的浓度变化。

食物样品(鱼肉、虾、牛肉、鸡肉、猪肉)称取5g，在超净工作台中用无菌器械切碎，放入50mL无菌离心管中,添加30mL PBS溶液，拧紧盖子后松两圈，至于25℃、相对湿度50%环境贮藏，时间设置为连续8天。每隔24h取样，每次取2mL,用0.22μm滤膜过滤，冷冻，食物样品标记为0、1、2、3、4、5、6、7天(制样当天为第0天)。

如图3示例，两个主要嗅觉受体OR，MOR203-1和MOR244-3对不同贮藏时间鱼肉的响应曲线。左侧为嗅觉受体对0天和2天的鱼肉实时响应曲线，横轴为检测时间（分钟），纵轴为相对发光强度（每个检测时间点的发光信号读值减去基线），结果显示，贮藏2天时间的鱼肉可以显著激活MOR203-1和MOR244-3，在15分钟内达到平台期。右侧为嗅觉受体对连续8天鱼肉样品的检测结果，横轴为（天），纵轴为发光强度差值（每天实时响应曲线发光信号最大值减去基线），结果显示，随着贮藏时间的增加，发光强度差值呈现增加趋势，在第4天基本达到峰值。

如图4示例，两个痕量胺受体mTAAR4和mTAAR5对不同贮藏时间鱼肉的响应曲线。与图1所示的两个主要嗅觉受体OR对鱼肉的响应情况类似。值得注意的是，TAAR对相同鱼肉样品的响应更强，相对发光强度和发光强度差值的数值为OR的3-4倍。图5为其他3个OR（OR2W1、MOR261-1、MOR256-17）与4个TAAR（hTAAR1、mTAAR1、mTAAR3、mTAAR7f）对不同贮藏时间鱼肉的响应曲线。

图6、图7、图8和图9分别为5个主要嗅觉受体（OR2W1、MOR203-1、MOR261-1、MOR256-17、MOR244-3）和6个痕量胺受体（hTAAR1、mTAAR1、mTAAR3、mTAAR4、mTAAR5、mTAAR7f）分别对虾、牛肉、鸡肉、猪肉四种食物样品的响应曲线。

不同食物样品在变质的过程中产生不同挥发性化合物，相同食物的不同储藏时间样品的挥发性化合物种类和含量亦不相同，食物产生的挥发性化合物刺激嗅觉受体组合产生的响应模式可以反映食物的状态。动物的嗅觉受体数量巨大，可利用本发明的检测方法筛选多种差异响应嗅觉受体。本发明提出了一种新的利用动物嗅觉受体评估食品品质的方法，可在15分钟完成对食物样品的快速检测，可扩展为一项操作简便、高通量、灵敏的食品安全监测技术。

本发明中表达嗅觉受体的细胞为HEK293T细胞，细胞可以是真核细胞，也可以是原核细胞；真核细胞是从酵母细胞、HEK293、CHO、非洲爪蟾卵母细胞、Hela、嗅觉基板分离的细胞群组中选出的。

本发明中测定待测物激活嗅觉受体的方法是通过检测荧光素酶的活性，还可以通过检测分泌性碱性磷酸酶、荧光蛋白、荧光探针、Ca2+浓度、电位、pH等变化。

实施例

嗅觉受体的表达和活性检测

（1）将OR2W1、MOR203-1、MOR261-1、MOR256-17、MOR244-3、hTAAR1、mTAAR1、mTAAR3、mTAAR4、mTAAR5、mTAAR7f的基因构建物与Golf、CRE-Luciferase以及pRL-SV40的基因构建物混合，并用转染试剂Lipofectamine2000转染至HEK293T细胞中。

（2） 24小时后，用不同浓度梯度的化合物刺激细胞并孵育3-4小时。

（3）利用双荧光素酶法测定荧光素酶的活性，以表征嗅觉受体的响应情况。

食品样品的快速检测

（1）将嗅觉受体、Golf、pGloSensor-20F cAMP的基因构建物用转染试剂Lipofectamine2000转染至HEK293T细胞中。

（2） 24小时后，将食物样品与细胞混合并孵育，利用实时发光技术检测细胞的发光强度变化，以评估食品样品的变质程度。

结论

本发明提供了一种利用动物嗅觉受体检测食品变质的方法，该方法操作简便、高通量、灵敏，可有效评估食品品质，实现食品安全监测。

权利要求

一种嗅觉受体，其特征在于，所述嗅觉受体选自以下：OR2W1、MOR203-1、MOR261-1、MOR256-17、MOR244-3、hTAAR1、mTAAR1、mTAAR3、mTAAR4、mTAAR5、mTAAR7f。
一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞表达权利要求1所述的嗅觉受体。
一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求2所述的重组细胞以及用于检测嗅觉受体活性的试剂。
权利要求1所述的嗅觉受体在检测食品变质中的用途。
权利要求2所述的重组细胞在检测食品变质中的用途。
权利要求3所述的试剂盒在检测食品变质中的用途。