fmkj1与xydb2蛋白相互作用研究：GST pull-down、共免疫沉淀、酵母双杂交和双分子荧光互补分析

fmkj1与xydb2蛋白相互作用研究：GST pull-down、共免疫沉淀、酵母双杂交和双分子荧光互补分析

本研究采用多种实验方法，探究了植物蛋白fmkj1与xydb2之间的相互作用关系。

方案1：GST pull-down和共免疫沉淀

为了进行谷胱甘肽S-转移酶（GST）pull-down，分别将pGEX-6p-1、pGEX-6p-1::fmkj1、pET28a和pET28a::xydb2质粒引入大肠杆菌菌株BL21（DE3），并在20℃下用0.5 mM异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导蛋白表达8小时。将相等量的GST-fmkj1和His-xydb2超声波裂解液与高亲和力的GST树脂（GenScript，Piscataway，NJ，USA）混合，在4℃下旋转孵育过夜。然后，用新鲜的10 mM谷胱甘肽洗脱缓冲液洗脱结合的蛋白质。接下来，用12% SDS-PAGE分离蛋白质，并用抗-GST或抗-His抗体（Proteintech，Rosemont，IL，USA）进行免疫印迹。

为了验证fmkj1和xydb2的蛋白相互作用，进行了共免疫沉淀（Co-IP）实验。将pCNG-fmkj1-GFP与或没有pCNF3-xydb2构建体系通过根瘤菌介导法在N. benthamiana中瞬时共表达。在根瘤菌介导法注入后的3天，用RIPA缓冲液破碎组织提取总蛋白质。然后进行-FLAG IP。用抗-GFP抗体对洗脱的蛋白质（25 ul）进行免疫印迹分析。大约25 ul含有总蛋白质的RIPA缓冲液被加载作为输入对照。

方案2：酵母双杂交系统

使用Matchmaker Gold酵母双杂交（Y2H）系统（Clontech，Palo Alto，CA，USA）验证IP-LC-MS/MS中的fmkj1相互作用蛋白质。将不含信号肽（SP）的fmkj1引入pGBKT7作为鱼饵，将不含SP的xydb2引入pGADT7作为猎物。按照制造商的说明，将鱼饵和猎物质粒共转化到酵母菌株Y2H Gold中。通过PCR扩增产生不同N-端区域缺失的截短fmkj1突变体，并将其亚克隆到pGBKT7中（表格S1）。转化的酵母细胞在合成缺失（SD）/-Trp-Leu板和含有X-a-半乳糖苷酶（X-a-gal）和Aureobasidin A（AbA）的SD/-Trp-Leu-His-Ade板上进行生长分析。

方案3：双分子荧光互补和亚细胞定位

使用分裂mCherry系统进行双分子荧光互补（BiFC）分析，如先前所述（Fan等人，2008; Li等人，2012）。使用引物RNSmF/RNSR扩增单体RFP（mCherry变体）的N端和C端片段，然后将其亚克隆到SmaI消化的pCNF3和pCNM3中（在pCNF3中使用3 x Myc代替3 x FLAG），生成pCNRNF3和pCNRCM3。将fmkj1和xydb2的编码序列引入pCNRNF3和pCNRCM3中，生成pCNRN-fmkj1和pCNRC-xydb2（图S2）。在N. benthamiana的叶片中进行BiFC，用适当的抗体通过Western印迹确认蛋白质表达。

对于亚细胞定位，将fmkj1和xydb2的编码序列引入pCNG和pCNR，分别进行瞬时表达。通过将N. benthamina细胞的碎片浸入1 M NaCl中10分钟进行质壁分离，然后进行共聚焦显微镜分析。在根瘤菌介导法注入后的3天监测N. benthamiana中的荧光，然后使用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）（Olympus FluoView FV1000）直接成像。使用的激发波长为488 nm（eGFP）和587 nm（mCherry）。