Pichia 克隆载体策略指南

本文档提供了一些在为以下载体开发克隆策略时需要考虑的指导方针。为了方便起见，每个载体的多克隆位点在接下来的页面中呈现。如果您使用的是 pPIC9K，将您的基因与 α-因子信号序列保持框架一致非常重要。

准备工作

我们建议您将这三个超螺旋拟革兰氏阴性菌表达载体转化到大肠杆菌中，以便您有一个永久的储备。

1. 使用无菌水或 TE 缓冲液将每个质粒稀释至 10-100 pg/μl。2. 将稀释后的质粒（1-2 μl）转化到感受态大肠杆菌中，并在含有 50-100 μg/ml 氨苄青霉素（LB-Amp）的 LB 培养基上进行筛选。

一般注意事项

以下是一些适用于 pAO815、pPIC3.5K 和 pPIC9K 的一般注意事项：

• Pichia 中的密码子使用被认为与酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）相同，许多酿酒酵母的基因在 Pichia 中被证明具有交叉功能。* 质粒构建应该在 recA、endA 突变的大肠杆菌如 TOP10F' 中进行维持。* 每个多克隆位点中都标有 AOX1 mRNA 的本地 5' 端。如果您需要基于任何原因分析 mRNA，这是计算感兴趣基因表达的 mRNA 大小所需要的。* 翻译终止由感兴趣基因中的终止密码子或 3' AOX1 序列中的终止密码子决定。每个图示的下一页中都标有 3' AOX1 序列中的终止密码子。* Pichia 和其他真核系统中已观察到由于 'AT 富集区域' 导致转录物过早终止（Henikoff 和 Cohen，1984 年；Irniger 等，1991 年；Scorer 等，1993 年；Zaret 和 Sherman，1984 年）。如果您在表达基因时遇到问题，请检查是否存在过早终止和 AT 富集区域。可能需要更改序列以实现基因的表达（Scorer 等，1993 年）。* pPIC9K 中 α-因子信号序列的预测蛋白酶切割位点在图示中（第 21 页）有标注。* 您必须将感兴趣成熟基因的开放阅读框架（ORF）与 pPIC9K 中的 α-因子信号序列保持框架一致并在其之后。