禽成髓细胞增多症病毒 (PEV) RNA 提取及 PCR 检测方法

对粪便样品进行10000 rpm/min离心10分钟，取上清液进行病毒RNA提取，使用TRIzol（Invitrogen）方法提取病毒总RNA。将提取的病毒RNA溶解在20μL不含RNase的水中。使用PEV-9 PCR引物对其进行扩增，第一轮PCR的PEV-9a上游引物为5'-GTACCTTGTACGCCTTTTTTA-3'，PEV-9b下游引物为5'-ACCCAAAGTAGTC GGTTCCGC-3'；第二轮的PEV-9c上游引物为5'-CAAGCACTTCTGTTCCCGG-3'，PEV-9d下游引物为5'-GTTAGGATTAGCCGC ATTCA-3'。这组引物的设计可以扩增病毒基因组的高度保守区域5'-UTR的313个核苷酸片段，能够检测PEV-9和PEV-10感染（图1）。

使用TaKaRa RNA PCR试剂盒进行RT反应，取4μL RNA溶液、2μL 25mM MgCl2、1μL 10x RT缓冲液、1μL10mM每个脱氧核苷酸、20 pmol PEV-9b引物、10U RNase抑制剂和2.5U禽成髓细胞增多症病毒RT-XL配成10μL体系。在42℃下反应30分钟，99℃下孵育5分钟以使产物变性，然后在冰上冷却。

使用PCR反应扩增病毒的cDNA，PCR体系为10μL cDNA、25μL负载染料混合物和25 pmol的上游引物和下游引物，总体积为50μL。PCR程序设定为：95℃下预变性5分钟，94℃下变性50秒，50℃下退火55秒，72℃下延伸1分钟，最后在72℃孵育5分钟。使用5μL第一轮PCR产物作为第二轮PCR的模板。第二轮PCR的程序设定参数与第一轮PCR相同。