LNP 结构的最新见解：冷冻电镜、SANS 和 NMR 研究

另一项最近的基于冷冻电镜技术的 LNP-mRNA 制剂形态学研究 [100] 发现存在几种不同的粒子群体。具体来说，使用硫脲染色法在冷冻电镜中显示，RNA 似乎定位在制剂的外缘（很可能夹在紧密相邻的脂质单层之间）或被围绕着双层突起的水相区域中。这项研究仍然是对 LNP 结构和组织的最直接分析，对 LNP 结构的物理干预非常有限。与使用冷冻保护剂相结合的超低温度和不受控制的冷冻相比，硫脲染色法是一种相对温和的探测 LNP-RNA 颗粒结构和定位的方法。

在 Kulkarni 等人提出的基于夹在紧密相邻的脂质单层之间的 siRNA 的 LNP 模型中 [94]，未与 siRNA 相互作用的离子化脂质可以在 LNP 中心形成无定形的油相（图 6C）。去质子化的离子化脂质与磷脂和胆固醇等两性分子相比几乎完全是疏水的。一旦离子化脂质去质子化，它的行为类似于甘油三酯，因此很可能会相分离成脂滴。请注意，离子化脂质的游离基衍生物（例如图 2A 中描述的离子化脂质）在室温下存在为油。对于含有 20 mol％离子化脂质 KC2、31.5 mol％ DSPC、47 mol％ 胆固醇和 1.5 mol％ PEG-脂质的 LNP，两个明显的相（通过冷冻电镜可视化），包括一个被提出的包含未带电的离子化脂质的油相和一个水相（图 6D）。中性离子化脂质倾向于相分离成为纯疏水环境的事实得到了在不同比例的 KC2 和 POPC 在 pH∼4 和∼7.5 pH 下的双层中的 MD 模拟的支持 [101]。在这项研究中，中性离子化脂质插入在 POPC 的疏水链的末端之间。一项有趣的单粒子荧光显微镜研究 [102] 表明，siRNA 聚集体在 LNP 中以非均匀的分布聚集，与上述模型非常吻合（图 6D）。

最近，使用 SANS 技术研究了离子化脂质、DSPC 和胆固醇在 LNPs 中的不同空间分布。利用氘化和非氘化脂质组分的不同散射特性表明，DSPC 脂质主要位于 LNP 表面，胆固醇在表面和核心中广泛分布，离子化脂质（MC3）主要存在于核心，但也在表面存在一定程度。这项独特的研究评估了 LNPs 中脂质分布，但从 SANS 数据中推导多参数关于多组分和多分散性 LNPs 的信息是具有挑战性的。一项采用动态核极化增强 NMR 光谱技术的研究也声称能够确定各种 LNP 组分的空间位置。SANS 研究和基于 NMR 的研究都支持 LNP 结构的同一基本理解：不同的脂质类型不仅与 LNP 的表面或核心相关联（与图 1 中的简单模型相反）；DSPC 和 PEG-脂质富集在表面；离子化脂质主要存在于核心。它们共同的模型进一步表明，胆固醇也主要位于核心。

这些研究表明，不同的 LNPs 具有非常不同的结构。胆固醇的小的物理化学变化 [99] 和离子化脂质是带电还是中性 [94] 都会对 LNP 结构产生重大影响。此外，单个脂质组分显着影响 LNP 的结构和生物学性质。复杂和大型的 MD 模拟、先进的 NMR 或其他技术可能在未来提供更详细的关于 LNPs 中脂质组分和核酸载体的分布和排列的信息。最终，这些信息与生物效应之间的相关性将使通过合理设计来改进 LNPs 的治疗应用成为可能。