LNP结构及其对基因转染效率的影响: 最新研究综述

LNP（脂质纳米颗粒）是一种用于传递药物和基因的纳米颗粒，具有广泛的应用前景。LNP的结构和脂质排列对其性能和效率具有重要影响。本文综述了最近的研究，通过冷冻TEM、分子动力学、小角度中子散射、小角x射线散射、荧光显微镜和NMR方法研究了LNP的结构和脂质排列。

1. 冷冻TEM揭示LNP结构的多样性

冷冻TEM提供了关于LNP尺寸、形状和内部形态的信息，并可以揭示分子排列是有序的、无序的还是相分离的。Eygeris等人的研究表明，LNP结构在很大程度上取决于脂质成分的分子结构、脂质组成、货物类型和颗粒内异质性。

胆固醇衍生物的类型对LNP的结构和脂质排列有重要影响。在胆固醇的情况下，LNP含有单一的脂质双层，而大多数含有饱和胆固醇的LNP具有多层结构。这项研究还量化了LNP内部具有不同电子密度的区域的内部缺陷比例，并提出了携带信使核糖核酸货物的不同LNP类型的结构模型。有趣的是，具有多层和多面结构以及层状脂质相的LNP显示出更高的基因转染率。然而，由胆固醇衍生物或胆固醇衍生物组分本身诱导的这些结构特征是否驱动改进的转染可能很难展开。

2. SAXS技术解析LNP内部结构

SAXS正成为表征LNP的一种流行技术。SAXS数据可以确定LNP的大小和结构，并指示LNPS是否包含有序结构，如多层脂质堆积和胆固醇微晶。最近另一项基于冷冻TEM的关于LNP mRNA制剂形态的研究确定存在一些不同的颗粒群体。具体而言，在冷冻TEM中使用硫堇染色法检测RNA，作者证明RNA似乎定位在制剂的外缘（可能夹在紧密附着的脂质单层之间）或被双层突起包围的水性隔室中。本研究仍然是对LNP结构和组织的最直接分析，对LNP的结构进行的物理干预非常有限。与使用冷冻保护剂与超低温和不受控制的冷冻相结合相比，使用硫堇是探测LNP-RNA颗粒的结构和定位的一种相对温和的方法。

在Kulkarni等人提出的基于夹在紧密附着的脂质单层之间的封装siRNA的LNP模型中，不与siRNA相互作用的可电离脂质可以采用位于LNP中心的无定形油相（图6C）。与磷脂和胆固醇等两亲性分子相比，去质子化的可电离脂质几乎完全是疏水性的。一旦可电离的脂质去质子化，它的行为与甘油三酯类似，因此很可能会相分离成脂滴。请注意，可电离脂质的游离碱衍生物，如图2A所示，在室温下以油的形式存在。对于含有20mol%的可电离脂质KC2、31.5mol%的DSPC、47mol%的胆固醇和1.5mol%的PEG脂质的LNP，两个不同的相（如通过冷冻TEM观察到的）是明显的，包括所提出的含有不带电的可离子化脂质的油状相和水相（图6D）。中性可电离脂质倾向于相分离到纯疏水性环境中，这一点得到了在pH 4和7.5pH下含有不同比例的KC2和POPC的双层的MD模拟的支持。在本研究中，中性可电离脂质插入POPC疏水链的末端。一项有趣的单粒子荧光显微镜研究表明，siRNA簇以非均匀分布聚集在LNP内，与上述模型非常一致（图6D）

3. NMR揭示LNP中脂质的具体排列

NMR也可以用于研究LNP的结构和脂质排列。NMR可以提供有关脂质分子的位置和取向的信息。最近使用SANS[54]研究了LNP中可电离脂质、DSPC和胆固醇的不同空间分布。利用氘化和非氘化脂类组分的不同散射财产发现，DSPC脂类主要位于LNP表面，胆固醇广泛分布于表面和核心，可电离脂类（MC3）主要位于核心，但在一定程度上也存在于表面。这项独特的研究评估了LNP中的脂质分布；也就是说，从SANS数据中导出关于多组分和多分散LNP的多参数信息是具有挑战性的。一项采用动态核极化增强核磁共振波谱的研究也声称能够确定各种LNP成分的空间位置。SANS研究和基于NMR的研究都支持对LNP结构的相同一般理解：不同的脂质类型不仅与LNP的表面或核心相关（与图1所示的简单模型相反）；1）；DSPC和PEGlipid在表面富集；并且可离子化脂质主要存在于核心中。他们的共同模型进一步表明，胆固醇也主要位于核心。

4. LNP结构与基因转染效率的关系

总而言之，这些研究表明，不同的LNP具有非常不同的结构。胆固醇的微小理化变化以及可电离脂质是带电的还是中性的都会极大地影响LNP的结构。此外，单个脂质成分显著影响LNP的结构，从而影响其生物财产。复杂和大型MD模拟、先进的NMR或其他技术可能在未来提供关于LNP中脂质成分和核酸货物的分布和排列的更详细的信息。最终，这些信息与生物效应之间的相关性将使通过合理设计提高LNPs的治疗应用成为可能。

5. 展望

LNP的结构和脂质排列对其性能和效率具有重要影响。最近的研究通过冷冻TEM、分子动力学、小角度中子散射、小角x射线散射、荧光显微镜和NMR方法研究了LNP的结构和脂质排列，为LNP的制备和应用提供了重要的参考。未来，需要进一步深入研究LNP的结构，尤其是不同脂质成分的空间分布和相互作用，以及LNP结构与基因转染效率之间的关系，为LNP的设计和优化提供更准确的理论依据。