计算设计和筛选改进的 5-HT 生物传感器 iSeroSnFR

为了进行计算建模，我们从开放的、无配体的 iAChSnFR0.6 (6URU) 和封闭的、结合胆碱的枯草芽孢杆菌 OpuBC (3R6U) 的结构开始，并创建了一个封闭的、ACh 结合形式的 iAChSnFR 模型，使用罗塞塔（图 1 B）。使用 Open Eye Omega (霍金斯等人，2010 年), 并使用 RosettaLigand (本德等人，2016 年;戴维斯和贝克，2009）（图 1B和 1C）。接下来，Rosetta 蛋白质重新设计（泰勒等人，2016 年;廷伯格等人，2013 年) 用于优化 5-HT 结合口袋。总共预测了 250,000 个变体，并根据计算的配体相互作用进行了排序（STAR 方法）。合成、纯化前 18 个预测变体，并检查其对 5-HT 和其他配体（包括 ACh）的荧光响应（图 S2 B 和 S2C）。在 18 个变体中，变体 7 显示出对 10 mM 5-HT 的最大荧光响应（ΔF/F0 = 87% ± 20%），没有 ACh 响应（ΔF/F0 = −4% ± 1%），代表 5-HT 选择性提高 18 倍（图 S2 C）。然后选择这个名为 iSeroSnFR0.0（表 S2）的突变变体进行进一步优化。 第二步：随机森林建模 我们接下来使用 SSM 优化 iSeroSnFR0.0 以提高 5-HT 亲和力。我们使用随机森林 (RF) 模型来估计计算设计询问的每个位置的重要性（表 S2）。我们从 RF (66 > 170 > 143 > 188) (图 1 D) 中获取了四个排名最高的位置，并在每个站点分别和成对执行 SSM（使用简并 NNK 密码子）。我们筛选了总共 2,576 个变体，包括每个单站点文库的 92 个和每个双站点文库的 368 个，用于对 5-HT (10 mM) 的荧光响应。文库大小使用 TopLib 在线文库计算器 (2012 年 11 月). 在筛选的变体中，与 iSeroSnFR0.0 相比，约 100 个变体显示出改善的响应（约 2 至 3 倍）（图 1 E）。随后的分析表明，表现最好的变体经常在多个位置包含突变，并且每个位置 (66 > 143 > 170 > 188)（表 S2）对荧光响应的有序贡献与 RF 预测的几乎相同（66 > 170 > 143 > 188)（图 1 F）。没有单一突变显着提高 5-HT 亲和力，但突变组合通常优于单一突变（图 S2D). 这些结果表明，RF 有效地预测了有助于传感器响应的重要位置，同时，多个残基的有益贡献对于大规模改进至关重要。 第三步：广义线性模型 因为单个突变只提供了很小的改进，而组合提供了更好的结果，突变显然不是累加的。例如，我们发现包含 T66Y/H170A 的表现最好的变体具有 140% 的响应改进，而单独的 T66Y 和 H170A 分别仅显示 40% 和 10% 的改进（图 S2 D ）。接下来，我们将 GLM 应用于我们的数据集。这使我们能够从我们的文库中识别出有助于协同相互作用的单个突变——从而使我们能够设计小型目标文库。 GLM 预测每个位置的几个氨基酸突变将是有益的（图 1F；表 S3），其中 66Y、66P、143M、170A、188G、188P 和 188T 显示出最强的阳性预测。考虑到我们已经确定的有益 T66Y/H170A 突变体，我们决定合成变体，将它们与 GLM 预测的第 143 和 188 位氨基酸残基结合起来。在合成的 13 个变体中，12 个对 10 mM 5-HT 显示出更大的荧光响应比 iSeroSnFR0.0（图 1 G）（GLM 具有适度的预测性：伪 R2 = 0.31）。一种变体显示出比 iSeroSnFR0.0 提高 4.5 倍的响应，远高于任何 SSM 筛选的变体。在纯化的蛋白质中，该变体（T66Y/F143M/H170A/H188T，命名为 iSeroSnFR0.1 ）相对于 iSeroSnFR0.0（（ΔF/ F0 ）max = 480 ，荧光响应（ΔF/F0）max 增加> 9 倍% ± 14% 对比 50% ± 4%)，5-HT 亲和力增加 2 倍（900 ± 110 μM 对比 1.8 ± 0.5 mM）（图 1 H ）。 鉴于单轮 GLM 引导诱变的实质性改进，我们又进行了两轮筛选，然后进行 GLM 预测，招募 RF 预测的额外位置，并根据先前的经验添加其他优化生物传感器（例如，连接器连接cpGFP 与结合蛋白、cpGFP 与结合蛋白之间的界面，以及来自前几轮筛选的随机突变）（表 S2）。这些后续轮次以逐渐降低的 5-HT 浓度（第 2 轮：500 μM 和第 3 轮：50 μM）进行筛选，以富集具有更紧密亲和力的变体。每一轮之后，使用 GLM 对表现最好的变体进行测序和重新分析，以创建一个重点库；总共测试了约 13,000 个变体，其中 244 个被测序。第 2 轮的最佳变体（图 1 I) 来自 GLM 驱动的重点库，其响应比其父 iSeroSnFR0.1 提高了 8 倍，并被命名为 iSeroSnFR0.2。第 3 轮的最佳变体（图 1 J）比其父代 iSeroSnFR0.2 提高了 5 倍（图 2 A；表 S2）。我们将此最终版本命名为 iSeroSnFR，其中包含 19 个相对于 iAChSnFR0.6 的突变（图 2 A，PDB：6PER）；在纯化的蛋白质中，该变体对 5-HT 的亲和力为 310 ± 30 μM，最大值为 800% (ΔF/F0) （图 2 B）。