翻译：21 DOX targets to GSTP1 and inhibits its activityTo explore the potential target of DOX in the pathogenesis of DIC we conducted DOX-pulldown to investigate the proteins which specifically bind with

2.1 DOX靶向GSTP1并抑制其活性。 为了探索DOX在DIC发病机制中的潜在靶点，我们进行了DOX拉附实验，研究了DOX与小鼠心脏中特异性结合的蛋白质。通过SDS-PAGE和LC-MS/MS发现了7个候选蛋白质（图1A）。鉴于与心肌损伤的密切相关性（32, 33），选择GSTP1进行进一步研究。接下来使用BIAcore实验检测它们的结合常数，在不同浓度的DOX体外实验中显示与GSTP1具有特异性结合（图1B, C）。然后检测了不同浓度DOX处理下的GSTP1 mRNA和蛋白表达水平。GSTP1的mRNA和蛋白表达水平在DOX处理下没有显著变化（图1D, E）。尽管DOX不能影响GSTP1的mRNA和蛋白表达水平，我们推测它是否会影响GSTP1的活性。为了验证这个推测，我们纯化了重组的GSTP1蛋白，并通过SDS-PAGE和免疫印迹验证了其纯度和特性（附图S1A, B）。令人惊讶的是，我们发现DOX能够显著抑制体外GSTP1的活性（图1F）。同时，我们检测了DOX处理下H9c2细胞中的GSTP1活性，与体外结果一致（图1G）。 总的来说，初步结果表明DOX可以靶向GSTP1并抑制其细胞内或细胞外的活性，这在以前没有报道过。

2.2 GSTP1对DOX诱导的心肌病的保护作用。 由于DOX可以特异性地靶向GSTP1并抑制其活性，我们推测GSTP1可能是DIC中的一个重要介质或调节因子。为了在体内确定GSTP1的作用，通过尾静脉注射应用AAV9来调节GSTP1的表达谱。 建立了DIC模型，分析了心脏功能和心肌损伤程度。DOX处理导致心率（BPM）、射血分数（EF）、收缩分数（FS）和射血量与对照组（AAV-NC）相比明显下降，超声心动图评估结果显示这些异常改变被心脏特异性的GSTP1过表达所减轻（图2A-E）。此外，还检测了几种心力衰竭的生物标志物，包括Myh7（肌球蛋白-7）、Anp（心房利钠肽）和Bnp（脑利钠肽），以进一步评估心脏损伤。如我们的q-PCR结果所示，GSTP1过表达显著降低了DOX诱导的Myh7、Anp和Bnp的表达增加（图2F-H）。此外，通过Masson三色染色法调查了小鼠心脏的纤维化情况，结果显示DOX处理导致心脏纤维化，而GSTP1过表达则减轻了这种纤维化（图2I, 2J）。 我们还在斑马鱼和心肌细胞（H9c2，一种大鼠细胞系）中验证了这些发现。具体来说，使用Tg（cmlc2: GFP）斑马鱼胚胎作为实验动物模型，这是一种心肌细胞核和质膜标记为GFP的动物模型（34）。我们发现GSTP1的过表达缓解了DOX引起的心脏异常变化，包括心率降低、心脏形态变长、心室紧凑和心房壁变薄（附图S2A）。对于心肌细胞，利用慢病毒获得过表达GSTP1的H9c2细胞（附图S2B），与对照组（Lenti-NC）相比，Lenti-Flag-GSTP1细胞的细胞毒性较低，这些结果通过显微镜观察得到证实（附图S2C）。此外，不同浓度的DOX处理诱导了细胞毒性，并抑制了细胞内GSTP1的活性。这些异常变化被GSTP1的过表达所缓解，而被GSTP1基因敲除所加重（附图S2D-F）。综上所述，这些发现表明GSTP1的过表达减轻了DIC的进展。

2.3 GSTP1改善体外DOX诱导的铁死亡。 几项先前的研究表明，铁死亡在DIC的进展中起着重要作用。此外，选择性抑制铁死亡在DOX给药后明显改善了心脏功能（5, 35）。在本研究中，我们首先尝试确定GSTP1是否参与DOX处理心肌细胞铁死亡的调节。我们的初步分析显示，铁死亡活化剂RSL3导致心肌细胞存活明显下降。有趣的是，GSTP1过表达缓解了这种铁死亡细胞死亡，而GSTP1干扰则加剧了这种细胞死亡，这表明GSTP1参与了铁死亡的过程（附图S3A, S4A）。接下来，DCFH-DA染色显示DOX处理导致大量ROS产生，这是铁死亡的关键标志。值得注意的是，脂质ROS的增加通过GSTP1过表达减轻，而通过GSTP1敲除加重（附图S3B-D, S4B-D）。然而，DOX引起的凋亡和坏死对GSTP1过表达没有影响，表明GSTP1具有特异性的铁死亡作用（附图S3F）。铁死亡还表现为线粒体萎缩和铁超载。RSL3诱导的线粒体损伤和铁超载通过GSTP1过表达得到减轻（附图S3F-G, S4F-G）。 为了进一步验证GSTP1在DOX诱导的心脏铁死亡中的主导作用，检测了H9c2细胞中与铁死亡相关的参数。具体来说，DOX诱导的铁死亡细胞死亡、更高水平的ROS和脂质ROS水平通过GSTP1过表达得到减轻（图3A-D）。接下来，通过免疫荧光分析和透射电子显微镜检测了DOX处理下的线粒体损伤。观察到DOX处理导致明显的线粒体损伤，而GSTP1过表达减轻了这种损伤（图3E-F）。关于细胞内铁的检测，我们的结果显示DOX处理增加了铁（Fe2+和总铁）的水平，而GSTP1介入减轻了这种异常变化（图3G）。 总的来说，这些发现表明GSTP1通过抑制铁死亡来减轻DOX诱导的心肌细胞损伤，无论是在体内还是体外。与此同时，GSTP1可能是铁死亡的另一个重要介质，就像GPX4一样（附图S3）