翻译：24 DOX inhibits GSTP1 binding JNKRegarding the key role of GSTP1 in the process of ferroptosis mediated DIC we aimed to investigate further molecular mechanism downstream Previous studies reported

2.4 DOX抑制GSTP1与JNK的结合。 关于GSTP1在铁死亡介导的DIC过程中的关键作用，我们旨在进一步研究下游的分子机制。先前的研究报告称，GSTP1通过与JNK结合并阻止其磷酸化来抑制JNK信号通路。在氧化应激的作用下，JNK-GSTP1复合物解离(36)，JNK被激活，下游信号传导导致细胞凋亡(37, 38)。并且有报道称，GSTP1抑制与PDAC细胞中的JNK活性增强和ERK、NF-κB和Sp1活性抑制有关(39)。基于这些研究，我们进行了共免疫沉淀（CO-IP）实验，检测GSTP1是否能够与JNK结合。结果显示，在DOX处理下，GSTP1可与JNK特异性相互作用，而DOX处理下JNK的表达水平降低（图4A）。此外，在不同浓度的DOX处理下，GSTP1的表达没有显著变化，而p-JNK的表达显著增加，这表明DOX可以激活JNK的磷酸化（图4B）。这些结果表明，DOX抑制了GSTP1的活性，进一步降低了GSTP1与JNK的结合，激活了JNK的磷酸化（p-JNK）。为了进一步阐明这一分子机制，我们在DOX处理的基础上加入了JNK信号通路的激动剂和抑制剂。与预期一致，基于DOX预处理，JNK的磷酸化在激动剂和抑制剂处理下得到显著激活和抑制（图S4A）。 接下来，我们在GSTP1过表达的背景下验证了这些发现。我们发现，GSTP1的过表达减轻了DOX引起的JNK磷酸化（图4C，S5D）。此外，我们在小鼠心脏体内模型中检测了GSTP1、JNK和p-JNK的表达水平，结果表明，GSTP1的过表达可以减轻DOX诱导的p-JNK的变化（图4D）。 总之，这些结果表明，DOX抑制了GSTP1与JNK的结合，激活了p-JNK。然而，这些变化可以通过GSTP1的过表达逆转。

2.5 DOX激活JNK的磷酸化以促进铁死亡 基于上述分子机制的发现，我们倾向于研究GSTP1/JNK信号通路是否介导DIC的铁死亡。当在DOX预处理的基础上应用JNK信号通路的激动剂和抑制剂时，抑制剂缓解了DOX诱导的铁死亡。具体而言，细胞活力实验显示，激动剂引起的细胞毒性与DOX相似，而JNK抑制剂和GSTP1过表达分别逆转了细胞存活率的降低（图5A，S6A）。此外，我们应用流式细胞术和显微镜检查法测量了H9c2细胞中ROS和脂质ROS水平，结果显示在DOX和激动剂处理下，ROS和脂质ROS水平较高，而在GSTP1过表达和JNK抑制剂的情况下，较DOX和激动剂处理水平较低（图5B-D，S6B-D）。 除了检测细胞存活率、ROS和脂质ROS水平外，我们进一步检查了铁死亡的其他生物标志物，包括Ptgs2的mRNA表达水平（铁死亡的生化标志物）、线粒体损伤和Fe2+水平。与ROS和脂质ROS水平的变化一致，我们发现Ptgs2在DOX和激动剂处理下上调。相反，GSTP1的过表达和JNK抑制剂逆转了Ptgs2的高水平（图5D）。此外，通过JC-1试剂盒（用于检测线粒体损伤）的实验，我们还发现在DOX和激动剂诱导下，GSTP1的过表达和JNK抑制剂逆转了严重的线粒体损伤（图5E）。此外，DOX和激动剂处理引起的Fe2+过载被GSTP1的过表达和JNK抑制剂逆转（图5F）。 因此，这些结果表明，DOX通过靶向GSTP1激活JNK信号通路以促进DIC中的铁死亡。

2.6 Fer-1的应用改善了GSTP1介导的DIC的益处作用 为了进一步确定GSTP1介导的心脏损伤是否在体内依赖于铁死亡，我们在DOX注射前使用了一种选择性的铁死亡抑制剂Fer-1。与对照组（AAV-NC）相比，GSTP1的心脏特异性过表达和Fer-1处理显示出显著更高的存活率，缓解了心肌损伤并改善了心脏功能（图6A-E，S7A-E）。此外，在小鼠心脏体内模型中，GSTP1的过表达和Fer-1处理减轻了DOX处理下4-HNE的异常表达和线粒体损伤（图6F-H，S7F-H）。一致的是，体外的Fer-1补充显示出与GSTP1过表达相似的变化，减少了在DOX刺激下的MDA和ROS产生、心肌细胞死亡和线粒体损伤（图S8A-F）