翻译：Escape of some cells after senescence is associated with drug resistance after breast cancerchemotherapyDuring the experiment 250 nM doxorubicin was used to treat MCF7 cells for 2 hours thenthe dru

一些细胞在细胞衰老后逃逸与乳腺癌化疗后的药物抗性有关 实验中，使用250 nM柔红霉素处理MCF7细胞2小时，然后停药，将培养基替换为无药物的培养基进行持续培养。我们发现，衰老细胞逐渐凋亡，持续到大约第10天，并达到第15天。出现了逃逸的再增殖的衰老细胞克隆簇，随着时间的推移，单克隆簇逐渐增加（图2A）。 接下来，我们挑选出生长良好的逃逸衰老细胞克隆进行再培养，将这些细胞命名为MCF7-T（简称M7-T），然后进行SA-β-Gal染色，发现M7-T染色为阴性（图2B）。细胞周期实验显示，与衰老细胞M7-SE相比，逃逸细胞M7-T从G2/M期逃逸，G2/M期比例减少，S期增加，并且细胞周期分布与母体正常MCF7相似，表明衰老细胞逃逸了衰老诱导的细胞周期阻滞，并在柔红霉素停药后重新增殖（图2C）。此外，我们还通过CCK-8实验比较了正常MCF7细胞、衰老细胞M7-SE和逃逸细胞M7-T的IC50，结果显示M7-SE具有更强的药物抗性（图2D）。 我们知道，p21和p16在衰老细胞中高表达^16。在蛋白水平上，与衰老细胞M7-SE相比，M7-T的p21和p16的表达降低，Lamin B1的表达上调，表明M7-T逃逸了细胞衰老（图2E）。因此，我们推测柔红霉素诱导的衰老细胞与乳腺癌化疗后的药物抗性有关，而逃逸的衰老细胞与药物抗性的复发有关。 筛选衰老细胞的靶标标志物 将MCF7细胞用250 nM柔红霉素处理2小时，然后用无药物培养基替换。分别提取未处理的MCF7（对照组）细胞，停药后第5天的衰老MCF7（M7-SE）细胞和衰老MCF7（M7-SE）细胞。对逃逸细胞（M7-T）的mRNA，使用实时荧光定量PCR检测三个与衰老相关的标志物的转录水平差异，并以热图形式显示（图3A）。结果显示DCR2、p21、p16等指标在衰老组（M7-SE）中明显表达。接下来，我们比较了上述指标的蛋白水平。三组细胞的Western Blot结果显示DCR2、p21和p16的蛋白水平明显不同，可作为衰老细胞的候选标志物（图3B）。 此外，由于p21和p16在细胞核中表达^15,17，它们不适合作为随后超声分子探针的靶标标志物，而DCR2蛋白主要在细胞膜上表达^18.同时，通过免疫荧光实验，我们进一步验证了柔红霉素诱导的细胞M7-SE和正常MCF7中DCR2的细胞定位和表达（图3C）。细胞核被DAPI染色，DCR2被标记为FITC。结果显示，DCR2在衰老细胞M7-SE的细胞膜上明显高表达。 柔红霉素诱导乳腺癌细胞衰老并导致免疫微环境中巨噬细胞的M2极化 关于乳腺癌柔红霉素耐药过程中免疫微环境变化的原因，我们推测可能与衰老细胞密切相关。药物诱导的衰老肿瘤细胞可以分泌一系列可溶性因子，包括促炎细胞因子、趋化因子、生长因子、蛋白酶和生物活性外泌体，即细胞衰老相关的分泌表型（SASP）^19. SASP不是单一的表型，而是高度复杂、动态的，其组成在时间上发生剧烈变化，并且取决于衰老诱导剂和细胞类型^20. SASP可以产生促炎环境并招募免疫细胞，激活肿瘤免疫抑制网络，如髓系来源的抑制性细胞（MDSC）、调节性T细胞（Treg）和M2巨噬细胞，促进肿瘤免疫抑制的微环境，然后加速肿瘤的发生、发展和转移，导致免疫治疗的无效^21. 巨噬细胞分为M1型和M2型，其中M1型巨噬细胞可以吞噬肿瘤细胞，相反，M2型巨噬细胞具有促进肿瘤生长和侵袭的能力^22. 为了探究乳腺癌化疗耐药过程中肿瘤细胞衰老与免疫微环境中巨噬细胞极化之间的关系，我们使用PMA将THP1细胞转化为M0巨噬细胞后，与柔红霉素联合诱导乳腺癌细胞衰老。将细胞M7-SE共培养48小时，共培养模式如图4A所示。流式细胞术检测了共培养后M0巨噬细胞极化为M2巨噬细胞的比例。我们发现，与空白对照THP1组和未处理肿瘤细胞共培养THP1+MCF7组相比，与衰老细胞M7-SE共培养后的THP1形态明显变化，条状和分叉形态的比例增加。即，极化比例增加（图4B）。接下来，我们进行了流式细胞术实验，使用标记为APC-Cy7的CD163代表M2型巨噬细胞。结果显示，与单独培养THP1和CD163指标相比，与衰老细胞M7-SE共培养后，THP1和CD163指标显著上调，M2型巨噬细胞的比例显著增加（图4C）。结果显示，柔红霉素诱导乳腺癌细胞衰老后，免疫微环境中M2型巨噬细胞的极化比例发生了显著变化。为了进一步验证乳腺癌化疗耐药、衰老和免疫微环境变化之间的关系，我们随后对自发形成肿瘤的MMTV-PyMT小鼠进行了体内验证，空白对照组腹腔注射生理盐水，另外设置了两组小鼠，两组小鼠均以100 mg/ml浓度腹