格鲁吉亚国家医学研究所批准了动物使用(许可证号14-48)。动物可以自由进食和饮水。维斯塔大鼠(n = 30)年龄为8-10周,体重为200-250克,来自第比利斯国立医科大学的繁殖设施。大鼠手术使用醚麻醉。土耳其品种的母羊,体重为15-20公斤(n = 27),来自格鲁吉亚的认证设施,个体笼子内饲养。麻醉时,母羊肌肉注射0.03-0.05 mg/kg阿托品和0.5 mg/kg地西泮,然后静脉注射20 mg/kg氯胺酮和5 mg/kg二甲苯胺。为了止痛,手术后立即肌肉注射1 mg/kg酮洛芬,随后连续3天。为了避免败血症,每天肌肉注射2 mg/kg庆大霉素和头孢曲松酮各一次,连续6天。在麻醉后,动物进行恢复监测,观察正常活动和出血或其他并发症。

组织细胞脱细胞

脐动脉和静脉被插管并用含肝素的生理盐水冲洗。胎盘随后存放在-80°C。为了脱细胞,胎盘在4°C下加热后,通过动脉以1ml/min的速度,连续3个24小时期间,分别用pH为7.4的磷酸盐缓冲液(PBS),0.01%、0.1%和1%的十二烷基硫酸钠(SDS)溶液冲洗。为了去除SDS,胎盘用蒸馏水冲洗30分钟,用1%Triton X-100冲洗1小时,用PBS冲洗3小时。胎盘在含有青霉素和链霉素的PBS中存放在4°C下,最长可达7天,或者在排干PBS后无限期存储在-80°C。在某些情况下,胎盘被冷冻干燥并存储在-80°C。

DNA含量

组织DNA提取(G-spin试剂盒;iNtRON Biotechnology, Inc., Seongnam, Korea),并在260nm处测量(NanoDrop 1000;ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA)。

脱细胞胎盘的解剖学

对于血管解剖学,胎盘动脉和静脉被插管,用生理盐水冲洗以清除血液,并用50%乳胶水或红色氧化铅(Pb3O4 + PbO [М-])在松香油中制备铸模。对于血管造影,放射造影剂被注入胎盘动脉。对于电子显微镜(EM),样本被固定在戊二醛中,并在Tousimis Samdri-780关键点干燥器(Tousimis Research Corp., Rockville, MD)中干燥,然后对超薄切片进行金溅射镀膜(扫描电子显微镜,日立有限公司,东京,日本)。

脱细胞血管和移植

胎盘动脉段经过12小时的水灌注,然后按照先前的方法用肝素处理。(11)脱细胞的动脉用1%硫酸普鲁卡因在120mmHg的压力下充满,然后用水冲洗30分钟,并在1000U/ml肝素中浸泡48小时。血管在含有0.1%过氧乙酸的PBS中进行3小时的灭菌处理(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)。为了测试机械强度,将长度为2.5-3cm,直径为1.5-2.5mm的血管段的两端插入聚丙烯导管中,并用4-0丝线固定(Ethicon Inc., Somerville, NJ)。将其浸入37°C的生理盐水中,并通过一端增加压力,直到视频记录爆裂。为了测试血管连接动脉缺损的能力,将大鼠的颈总动脉在结扎之间切断。根据Zou等人的方法(11),在动脉的两端分别放置带有手柄的聚乙烯袖套,外径为0.7mm,内径为0.6mm。动脉末端的边缘被翻转到袖套上,并用9-0缝线将脱细胞的胎盘血管固定到袖套上。手术后5、10、15、30和40天处死大鼠。血管造影使用放射造影剂或荧光素。用福尔马林固定的移植物切片通过免疫染色进行蛋白质表达检测,包括desmin,α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和von Willebrand因子(vWF)(Abcam, Cambridge, UK)。

羊肝的收获和处理以及脱细胞胎盘的肝化

通过中线腹部切口,切除左叶肝脏(约占30%,通常为110-120g),并结扎其蒂。通过门静脉支进行肝脏冲洗,使用平衡盐水溶液(HBSS),pH为7.4。将肝脏用机械组织切割器在室温下切碎5-6分钟。通过两层手术纱布将>1-2mm大小的碎片去除,并将滤液收集在30ml HBSS中。通过尝试蓝染料排除法确定碎片的存活性。将碎片固定在福尔马林中进行组织学检查。为了进行肝化,修剪胎盘至所需大小,并通过灌洗生理盐水确认组织完整性。通过18-20g针头,每个胎盘小叶注射高达150ml的肝脏碎片,每个小叶注射10-15ml。通常,脱细胞胎盘的制备到使用的时间不超过30分钟。通过向血管注射着色的乳胶来测试肝化的胎盘。为了检测白蛋白分泌,使用RPMI 1640培养基以10ml/min的速率灌注3天。每天存储灌注液中的白蛋白含量。为了尿素合成,将5mM氯化铵加入灌注液中1小时,并在此期间每天收集灌注液。为了进行肝功能转运,将3.8mBq的99mTc-Bromo-Billaron(Medi-Radiopharma, Budapest, Hungary)注入胎盘动脉,并使用动态成像(Siemens E-cam伽马相机)进行成像,窗口设在140keV上,每帧5秒,持续1分钟,然后每帧1分钟。分析多个感兴趣区域。

羊中异位移植肝化胎盘

为了减少血栓形成,给予羊100U肝素静脉注射。在羊的右股动脉和静脉部分侧夹。在麻醉状态下,将肝化的胎盘植入髂腹股沟间隙的

请用地道、专业、科学、书面化的中文翻译如下内容:The Georgian National Medical Research Institute approved animal use Permit Number 14–48 Animals received unrestricted access to food and water Wistar rats n=30 were 8–10 weeks

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