请用地道、专业、书面化、具有强逻辑性的中文表达如下内容：221 The structure of dECMTo investigate the impacts of freeze-thaw treatment on the structure of dECM we characterized its surface morphology and pore size distribution The

2.2.1. dECM的结构

为了研究冻融处理对dECM结构的影响，我们对其表面形态和孔隙大小分布进行了表征。dECM膜包含了一个致密层和一个粗糙层（图2A和图S7，支持信息）。扫描电子显微镜（SEM）图像的定量分析表明，在经历7次冻融循环后，dECM的平均孔径从10 mm显著减小到5 mm。此外，在F/T 7组中，dECM的胶原纤维直径只有对照组的一半。网络孔隙大小和胶原束直径随着冻融循环次数的增加而减小，这在干态下的汞入侵孔隙度测定（MIP）和生理条件下的原子力显微镜（AFM）测定中得到了进一步的证实（图2A-E）。以前的研究已经报道了由于冻融处理过程中与水-冰相变相关的胶原纤维剥离而导致的类似结构变化[30,46]。

2.2.2. dECM的宏观力学性能

单轴拉伸试验是研究胶原膜宏观力学性能的常用方法，用于评估dECM的操作性能[[47],[48],[49]]。dECM表现出非线性弹性，应力和应变之间的关系近似呈指数关系（图2H）。经过三次冻融循环后，dECM的宏观刚度和极限拉伸强度显著提高，而应变减小（图2I、J和K）。dECM在拉伸试验中的变形过程包括四个区域：脚趾区、脚跟区、弹性区和破裂区[50,51]。三个组的脚趾区表现出相似的性能，说明用于去除宏观皱褶的应力相同。在F/T 3组中，脚趾区发生了早期的屈曲增强，导致了较低的破裂应变。此外，需要更多的能量来拉伸屈曲并解锁弹性区的三螺旋结构（图2F）。我们推测，冻融处理通过影响胶原纤维水平上的dECM，改变了dECM的弹性模量。

2.2.3. dECM的纳米和微米力学性能

原子力显微镜（AFM）是一种强大的技术，可以在从kPa到GPa的生理条件下提供结构和力学信息。AFM使用金字塔状探针对dECM进行了纳米力学性能评估，提供了结构和力学信息（图3A）。dECM胶原纤维网络的弹性模量在对照组、F/T 3组和F/T 7组分别为0.56、0.76和0.95 MPa，随着冻融循环次数的增加而提高（图3B和C）。为了关注个别胶原纤维而不是整个膜，我们在更细的范围内进行了AFM测量，并发现胶原纤维的弹性模量随着冻融循环次数的增加而增加（图3D和E）。尽管经过七次冻融循环的dECM的个体胶原纤维具有较高的纳米弹性模量（通过使用金字塔状探针的AFM纳米压痕仪测定获得），但是dECM的宏观和微观弹性模量却随着冻融循环次数的增加而降低。值得注意的是，dECM的总体力学性质不仅由个体胶原纤维的弹性模量决定，还受到胶原网络结构的影响，而这也受到冻融循环的影响。我们显示，经过七次冻融循环处理导致dECM的孔隙大小显著减小，表明形成了更加致密的胶原网络。这导致该组的总体弹性模量降低。因此，需要探索最佳的冻融循环次数，以实现理想的个体胶原纤维弹性模量，而不会损害胶原网络的整体结构。

此外，我们进行了有限元分析（FEA）来模拟胶原网络与金字塔状探针之间的相互作用。如图3F所示，应力和变形集中在个别胶原纤维上，在金字塔状探针检测期间不会干扰胶原网络的结构。尽管金字塔状探针允许更高的空间分辨率检测，但是球状探针检测到的微环境可能更接近细胞感受到的刚度[52,53]。因此，我们使用球状探针来测量dECM的微弹性模量（图4A、B、C）。然而，由于样品不够平坦和稳定固定，很难获得大量有效数据来进行AFM测量[54]。冷冻切片是克服这一障碍的理想助手，因为它对dECM的弹性模量影响很小[55]。因此，我们利用冷冻切片来获得精确高效的微机械性能测量。F/T 3组中，用球状探针探测的dECM切片的弹性模量高于其他两组（图4D和E）。值得注意的是，金字塔状探针的结果与球状探针的结果不同。相反，球状探针与胶原网络之间的接触面积更大，表明该测量干扰了胶原网络的结构，并且变形和应力在更大的区域内改变（图4F）。这些结果验证了球状探针可以提供关于微尺度刚度和结构的信息，表明球状探针可以更好地反映细胞的"感受" [52]。

水合水平对于基于胶原的材料（如dECM）的力学性能具有明显影响[56]。在干燥状态下，dECM的弹性模量在MPa级别，而在湿润状态下可以增加到GPa级别[57]。这是因为脱水微纤丝中的胶原分子在变形过程中主要是直立而不是拉伸[58]。因此，评估在完全水合条件下的胶原基材料的力学性能是保证与生理相关结果的关键[59]。

冻融处理对基于胶原的材料的影响与最低设置温度、冷却速率、冷冻保持时间、解冻介质和循环次数等有关[46,60,61]。在我们的研究中，我们发现冻融处理减小了胶原纤维的直径并增强了其刚度，而刚度随着冻融循环次数的增加而增加。这表明一定数量的冻融循环可以增强dECM的力学性能，而超过这个数量可能会导致结构损伤和力学性能退化。总的来说，冻融处理可以是制备机械可调的dECM的有效方法