如何用冻存RKO细胞制备样品用于western blotting检测某一蛋白的表达量

以下是使用冻存RKO细胞制备样品用于Western blotting检测某一蛋白表达量的步骤：

1. 培养RKO细胞：使用培养基（如DMEM）将RKO细胞培养至合适的密度。注意，细胞应处于对照组和处理组中。

2. 收集细胞：用无菌PBS洗涤细胞，然后用胰蛋白酶等酶解液将细胞从培养板上收集下来。将细胞转移到离心管中。

3. 离心：将细胞离心以去除培养基和酶解液。将上清液去除，留下细胞沉淀。

4. 冻存细胞：根据冻存液的配方，向细胞沉淀中加入合适的冻存液，并轻轻混匀。将细胞冻存液均匀地分装到冻存管中。

5. 冻存：将分装好的细胞冻存液放入-80℃的冰箱中冷冻。在冷冻过程中，细胞将逐渐冷冻并保存。

6. 解冻细胞：当需要使用样品时，将冻存管从-80℃的冰箱中取出，并立即将其放入37℃的水浴中解冻。解冻后，立即将细胞沉淀转移到无菌离心管中。

7. 离心：将细胞离心以去除冻存液。将上清液去除，留下细胞沉淀。

8. 裂解细胞：向细胞沉淀中加入细胞裂解液（如RIPA缓冲液）并轻轻混合。将细胞裂解液在冰上孵育一定时间，使细胞完全裂解。

9. 离心：将细胞裂解液离心以去除细胞碎片和细胞核等残留物。将上清液（蛋白提取液）转移到新的离心管中。

10. 蛋白浓度测定：使用蛋白浓度检测试剂盒（如BCA法）测定蛋白提取液中的蛋白浓度。

11. SDS-PAGE凝胶电泳：根据需要的蛋白分子量，将蛋白提取液中的蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳分离。

12. 转膜：将分离好的蛋白转移到PVDF或NC膜上。

13. 阻断：将转膜的蛋白用5%脱脂奶粉或3% BSA等阻断液进行阻断，以减少非特异性结合。

14. 一次抗体孵育：将特异性一抗加入阻断液中，与目标蛋白结合。在4℃下孵育一夜。

15. 洗涤：用TBST洗涤膜上未结合的一次抗体。

16. 二次抗体孵育：将特异性二抗加入阻断液中，与一抗结合。在室温下孵育1-2小时。

17. 洗涤：用TBST洗涤膜上未结合的二次抗体。

18. 显色：使用ECL或其他适当的显色试剂对蛋白进行可视化。

19. 成像：使用化学发光成像系统对蛋白条带进行成像和记录。

通过以上步骤，您可以使用冻存的RKO细胞制备样品进行Western blotting检测某一蛋白的表达量