三代测序技术：克服二代测序读长短的缺陷

为了克服二代测序中读长短的缺陷，三代测序技术应运而生，其特点是具有超长的读长，并且无需对DNA进行亚硫酸氢盐转化或酶切等处理。目前主流的三代测序平台包括Pacific Biosciences (PacBio) 公司的单分子实时测序技术 (Single Molecule Real-Time Sequencing, SMRT) 和Oxford公司的纳米孔 (Nanopore) 测序技术。SMRT测序[113]采用了边合成边测序的思想，利用了一面带有几十上百万个直径为几十纳米的小孔，称为零模波导孔 (zero-mode waveguide, ZMW) 的金属片。在零模波导孔底部，锚定着测序模板 (DNA单链) 和DNA聚合酶，同时包含着四种被不同荧光基团修饰的dNTP。由于每次添加的dNTP所携带的荧光颜色是不同的，在激光的激发下可以发出不同的荧光。在通过DNA聚合酶的过程中，具有化学修饰的碱基通过速度较慢，这种减慢可以反映在荧光信号的间隔上。通过检测不同波长和峰值以及它们之间的间隔，可以进行DNA甲基化水平的检测。