肝癌中ARAP1基因选择性启动子活性变化及功能研究

根据专家二的建议，本研究进一步补充了相关实验验证。结合肝癌细胞系HepG2的多组学分析，我们重点对ARAP1基因进行了细胞验证实验。ARAP1基因具有两个活性变化相反的选择性启动子，其中prmtr.61501（对应长转录本ARAP1-L）的活性显著增加，而prmtr.61499（对应短转录本ARAP1-S）的活性显著下降。正是这种‘跷跷板’式的启动子活性变化，导致我们无法在肝癌中观察到ARAP1基因整体表达的变化。进一步通过与甲基化的相关性分析，发现ARAP1这两个选择性启动子的活性与对应甲基化状态呈显著负相关。根据甲基化状态进行的预后分析发现，ARAP1-L（prmtr.61501）的高甲基化状态与更差的预后相关，而ARAP1-S（prmtr.61499）的高甲基化状态与更好的预后相关。本研究推测转录本ARAP1-L和ARAP1-S在肿瘤进展中的功能是相反的。

为了对ARAP1进行更深入的研究，本研究进行了以下实验分析：首先，通过公共的CAGE数据集和RT-qPCR实验验证了肝癌细胞系HepG2中ARAP1-L具有显著的CAGE信号和较高的转录本表达，而ARAP1-S几乎未检测到CAGE信号且转录本表达较低。其次，通过BSP检测发现，HepG2中ARAP1-S呈现高甲基化状态，而ARAP1-L具有更宽的DNA低甲基化峡谷。进一步，本研究使用DNA甲基化靶向编辑技术（CRISPR-dCas9-Tet1CD）降低ARAP1-S的甲基化状态后，发现ARAP1-S转录本表达增加，证实了ARAP1-S的启动子在HCC中受到DNA甲基化状态的调控。最后，通过shRNA和慢病毒过表达系统调控ARAP1不同转录本的表达，并构建稳定转染的HepG2细胞，本研究进一步通过细胞表型实验发现，ARAP1-S能抑制细胞迁移和侵袭，而ARAP1-L能促进细胞迁移和侵袭。