脱细胞胎盘生物工程化构建生物人工肝

人体组织

经第比利斯国立医科大学伦理委员会批准, 本研究获取了人体胎盘. 所有胎盘捐献者均已签署知情同意书, 且为健康、无并发症的足月妊娠孕妇. 胎盘的收集工作在标准临床护理下, 于分娩后立即进行.

动物

本研究中所有动物实验均获得格鲁吉亚国家医学研究所批准（许可证编号：14-48）. 所有实验动物均可自由进食和饮水. 实验所用Wistar大鼠（n=30）, 年龄为8-10周, 体重为200-250克, 均来自第比利斯国立医科大学动物实验中心. 大鼠手术采用乙醚麻醉. 实验所用土耳其品种母羊（n=27）, 体重为15-20公斤, 均来自格鲁吉亚一家获得认证的养殖场, 单独圈养. 麻醉时, 绵羊接受肌肉注射0.03-0.05 mg/kg阿托品和0.5 mg/kg地西泮, 然后静脉注射20 mg/kg氯胺酮和5 mg/kg甲苯噻嗪. 为减轻疼痛, 手术后立即肌肉注射1 mg/kg酮洛芬, 随后连续3天. 为预防败血症, 每天两次肌肉注射2 mg/kg庆大霉素和头孢曲松, 持续6天. 麻醉后, 对动物进行监测, 观察其恢复情况、正常活动以及出血或其他并发症.

组织脱细胞化

对脐动脉和静脉进行插管, 并用含有肝素的生理盐水进行灌注以清除血液. 然后将胎盘储存在-80°C. 脱细胞化时, 将胎盘回温至4°C, 并通过动脉灌注pH值为7.4的磷酸缓冲盐水（PBS）过夜, 随后分别使用0.01%、0.1%和1%的十二烷基硫酸钠（SDS）溶液进行灌注, 每次24小时, 流速为1 ml/min. 为去除SDS, 使用蒸馏水灌注胎盘30分钟, 然后使用1% Triton X-100灌注1小时, 最后使用PBS灌注3小时. 将胎盘储存在含有青霉素和链霉素的PBS中, 4°C保存, 最长可达7天, 或在去除PBS后, -80°C冻存. 在某些情况下, 将胎盘冷冻干燥并储存在-80°C.

DNA含量

使用试剂盒（G-spin Kit; iNtRON Biotechnology, Inc., Seongnam, Korea）提取组织DNA, 并在260 nm处进行测量（NanoDrop 1000; ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA）.

脱细胞化胎盘的解剖结构

为观察血管解剖结构, 对胎盘动脉和静脉进行插管, 并用生理盐水进行灌注以清除血液, 然后使用50%水合乳胶（NAIRIT L-3, NAIRIT）或铅丹（Pb3O4 + PbO [М-]）/松节油混合物进行灌注, 制备血管铸型. 血管造影通过向胎盘动脉注射造影剂进行. 对于电子显微镜（EM）观察, 将样品固定在戊二醛中, 并在Tousimis Samdri-780临界点干燥器（Tousimis Research Corp., Rockville, MD）中干燥, 随后对超薄切片进行镀金处理（扫描电子显微镜, Hitachi Ltd., Tokyo, Japan）.

脱细胞化血管和移植

对胎盘动脉段进行水灌注12小时, 并按先前描述的方法进行肝素处理 (11). 使用1%硫酸鱼精蛋白对脱细胞化的动脉进行灌注, 压力为120 mmHg, 然后用水灌洗30分钟, 并在1000 U/ml肝素溶液中浸泡48小时. 使用含有0.1%过氧乙酸的PBS对血管进行消毒, 时间为3小时. 为了测试机械强度, 将长度为2.5-3 cm、直径为1.5-2.5 mm的血管段两端连接聚丙烯导管, 并使用4-0缝线固定（Ethicon Inc., Somerville, NJ）. 将血管段浸入37°C的生理盐水中, 并从一端泵入生理盐水, 逐渐增加压力, 直至血管破裂, 并进行录像记录. 为评估血管桥接动脉缺损的能力, 将大鼠颈总动脉在两处结扎之间切断. 根据Zou等人(11)的方法, 将外径为0.7 mm、内径为0.6 mm的聚乙烯套管分别套在动脉的两端. 将动脉断端的边缘翻转到套管上, 并使用9-0缝线将脱细胞化的胎盘血管固定在套管上. 分别在术后5、10、15、30和40天处死大鼠. 血管造影使用造影剂或荧光素进行. 对福尔马林固定的移植物切片进行免疫染色, 检测desmin、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和von Willebrand因子（vWF）（Abcam, Cambridge, UK）.

羊肝的获取和处理以及脱细胞化胎盘的肝细胞化

在中线开腹后, 结扎左肝叶的肝蒂并切除左肝叶（约占肝脏总体积的30%, 通常为110-120克）. 通过门静脉分支, 使用Hanks平衡盐溶液（HBSS）对切除的肝脏进行灌注. 使用机械组织匀浆器在室温下将肝脏切碎, 时间为5-6分钟. 该时间已在早期研究中确定. 使用两层医用纱布过滤匀浆液, 去除尺寸大于1-2毫米的组织碎片, 并将滤液收集到30毫升HBSS中. 使用台盼蓝染色法检测组织碎片的活力. 将组织碎片用福尔马林固定, 用于组织学检查. 对于肝细胞化, 将胎盘修剪至合适的大小, 并通过生理盐水灌注确认组织的完整性. 使用18-20号针头, 将多达150毫升的肝脏组织碎片注射到胎盘囊中, 每个胎盘叶注射10-15毫升. 通常情况下, 从脱细胞化胎盘制备到使用的时间小于30分钟. 通过向血管注射有色乳胶, 对肝细胞化的胎盘进行测试. 为了检测白蛋白分泌, 以10 ml/min的流速灌注RPMI 1640培养基, 持续3天. 每天收集灌注液, 用于检测白蛋白含量. 为了检测尿素合成, 向灌注液中添加5 mM氯化铵, 持续1小时, 并在这一小时内每天收集灌注液. 为了评估肝脏转运功能, 向胎盘动脉注射3.8 MBq的99mTc–Bromo-Billaron（Medi-Radiopharma, Budapest, Hungary）, 并进行动态成像（Gamma-camera Siemens E-cam）, 使用以140 keV为中心的20%窗口, 前1分钟每5秒采集一帧图像, 随后59分钟每分钟采集一帧图像. 对多个感兴趣区域进行分析.

异位移植肝细胞化胎盘到绵羊体内

为减少血栓形成, 给予绵羊100 U肝素静脉注射. 对绵羊的右侧股动脉和股静脉进行部分侧方钳夹. 将肝细胞化的胎盘皮下移植到腹股沟区. 使用6-0缝线将胎盘血管与股动脉和股静脉进行端侧吻合, 然后恢复移植肝的血液灌注. 使用多普勒超声（Logiq7 Ultrasound Machine, GE Electronics, Tbilisi, Georgia）和CT血管造影（Innova-3100 Digital Cath & Angio machine, GE）检查血管血流情况, CT血管造影使用ULTRAVIST-300造影剂, 注射速度为3-5 ml/秒, 总量为50 ml. 根据既定方案识别动脉期、静脉期和肾脏期.

绵羊急性肝衰竭部分肝切除模型

在中线开腹后, 游离肝叶, 并切除除部分左叶和整个尾状叶以外的所有肝组织, 构成85%的肝切除. 使用5-0缝线或纤维蛋白（Tissucol®, Baxter）进行止血, 并确保没有胆汁泄漏. 在完成部分肝切除后, 将肝细胞化的胎盘移植到绵羊体内, 此时绵羊仍处于麻醉状态. 定时采集血样. 使用戊巴比妥钠静脉注射对动物实施安乐死. 在尸检时, 记录肝脏和移植肝的尺寸, 以估计器官体积, 并参考健康绵羊的肝脏样本（包含血液）, 将器官体积转换为重量. 同样, 记录胎盘移植肝的尺寸, 用于不同动物组之间的比较.