去细胞化人胎盘促进肝化：一项新的肝脏再生策略

包括腐蚀铸件在内的解剖学研究揭示了胎盘和胎盘叶中丰富的动脉和静脉网络。这对于植入了肝脏的胎盘叶内的组织灌注和质量传递非常重要。去细胞化后，血管结构完整，没有明显的膨胀或削弱（图1A）。去细胞化后的DNA含量是完整胎盘的<1%（每毫克干重4.6μg DNA）。有核细胞被去除，基质得到了很好的保留（图1B, 1C）。电子显微镜验证了具有ECM突起的空心血管和腔内空间（图1D）。此外，血管造影显示，进入胎盘叶的主要和分支胎盘血管完整且迅速充盈（图1E）。这种对比剂从胎盘叶中进出的过程在几秒钟内完成（支持视频1）。这些参数对于组织工程来说具有自然重要性。我们还检查了在4°C的盐水中储存数天或在-80°C的低温冷冻干燥数月后的去细胞化胎盘，发现它们完整无损。

为了确保去细胞化血管的适用性，我们测试了其耐破裂的抗拉强度（支持图S2）。在去细胞化或未去细胞化的动脉段（各n=10），包括在-80°C的储存，平均破裂点分别为250千帕（kPa）和210千帕，p>0.05。这些去细胞化的血管在大鼠的动脉缺损中起到了桥接作用（支持图S3），所有移植物在0、3、5或20天后都显示出良好的颜色和血流（支持图S4）。血管造影证实了移植物的通畅性。类似地，去细胞化的静脉也可以桥接颈静脉缺损（未显示）。组织学证实了移植物腔内在40天的时间里保持通畅。值得注意的是，移植的血管内含有从原生组织迁移而来的表达vWF的内皮细胞和表达α-SMA和desmin的基质细胞。

为了移植肝化胎盘，我们修剪了多余的组织，并通过胎盘囊注入供体肝脏（支持图S5）。组织学验证了肝脏碎片中包含多种细胞类型，尽管经过针头穿刺，组织仍然完整。血管铸件和血管造影证实了移植组织的灌注情况（未显示）。在胎盘内植入并在离体条件下灌注3天后，组织保持了脐带结构和窦道，并且健康（支持图S5）。为了确定质量传递情况，我们用99mTc-美洛芬灌注肝化胎盘，该示踪剂通过定义的转运体（溶质载体家族和Abcc2的成员）进入和退出肝细胞。（14）示踪剂在5-10分钟内均匀地进入肝化胎盘，并在60分钟内逐渐清除（支持图S6）。这种99mTc-美洛芬的摄取和排泄动力学与动物和人体中的情况相似。（10, 14）此外，它再次强调了肝组织的灌注情况。在与10-20%绵羊肝脏进行肝化的胎盘中，白蛋白在1、2和3天时分别分泌到2.0±0.2 g/l、3.4±0.3 g/l和3.0±0.8 g/l的灌注液中。在氯化铵输注的60分钟样本中，尿素在1、2和3天时分别产生到3.1±2.2 mg/l、3.4±1.9 mg/l和4.8±1.4 mg/l。这种肝脏传输和合成功能的证明，加上血管造影和放射示踪证据表明移植物的灌注情况，为体内肝化胎盘的研究奠定了基础。

为了避免排斥反应，我们使用了自体绵羊肝脏。去细胞化的胎盘提前存储。为了适应腹股沟区域的移植物并避免血管“偷窃”现象，在与股动脉血管吻合之前，修剪了多余的胎盘组织（支持图S7）。我们在移植后的1、5-7、14-15、20、30和45天检查了肝化胎盘（每个1-2个，共计10个）（支持表1）。在肝脏获取过程中，没有绵羊因肝脏切除而丧命。在某些情况下，通过铸件验证了肝化胎盘的灌注情况（图2A）。乳胶进入肝化胎盘并出现在肝组织中。通常情况下，我们在绵羊肝脏获取后的25-60分钟内移植肝化胎盘。在血管吻合后立即，移植物灌注良好，没有过度膨胀或破裂。随后，移植物产生了可见的腹股沟突出。移植肝化胎盘没有引起任何疾病或死亡。在移植后的1、10、15和45天评估显示胎盘和股动脉血管吻合处均健康。移植后1天的组织学显示胎盘叶和血管充满了血液（图2B）。随后，组织融合形成了连续的肝脏片，其中包含肝细胞和窦道，窦道中含有血液和其他细胞，周围由胎盘叶的结缔组织基质所包围，其他细胞类型也寄居在胎盘囊内。