如何鉴定和处理成纤维细胞？- 附实验步骤和方法

如何鉴定和处理成纤维细胞？ - 附实验步骤和方法

本文详细介绍了成纤维细胞的鉴定和处理方法，包括以下几个方面：

1. 成纤维细胞鉴定

• 将第3代成纤维细胞（密度为1×10⁵个细胞/孔）接种到预先涂覆玻片的12孔板中，培养48小时[19]。* 用4%的多聚甲醛固定细胞10-15分钟，然后用PBS冲洗3次。* 使用0.5%的Triton X-100透化细胞10分钟。* 使用3%的过氧化氢孵育细胞5分钟，以淬灭内源性过氧化物酶活性。* 用PBS冲洗细胞，并用山羊血清在室温下封闭10分钟。* 在4℃下用Pan-CK（ab215838; Abcam Inc.，Cambridge, MA, USA）和Vimentin（ab8978，Abcam）一抗孵育细胞过夜。* 次日，将细胞在37℃下复温30分钟，用PBS冲洗。* 在37℃下用二抗（ab205719，Abcam）孵育细胞15分钟。* 使用2,4-二氨基丁酸（ZSGB-BIO，中国北京）显色，用中性树脂封片。* 在光学显微镜（OLYMPUS Optical Co.，Ltd，日本东京）下观察。

2. 成纤维细胞处理

• 将成纤维细胞用不同浓度（0、0.5、1、5、10 ng/mL）的白细胞介素（IL）-1β（Peprotech，Rocky Hill，NJ，USA）或10 mmol/L 3-甲基腺嘌呤（3-MA）（Sigma-Aldrich，Merck KGaA，Darmstadt，德国）处理24小时[20]。

3. Nampt基因沉默

• 为了下调成纤维细胞中Nampt的表达，使用以下3种慢病毒（LV）包装的短发夹（sh）RNA（均购自中国上海基因化学有限公司）：Nampt shRNA 1#，Nampt shRNA 2#和Nampt shRNA 3#，并以LV包装的乱序阴性shRNA作为对照。* 将细胞（1×10⁵个细胞/孔）接种到6孔板中，并在转染前24小时进行培养。* 当细胞密度达到约50%时，在含有聚凝胺（5 μg/mL，感染复数=10）的培养基中用LV转染细胞12小时。* 之后，将含有LV的培养基替换为4 mL新鲜培养基。* 72小时后，使用含有嘌呤霉素（4 μg/mL Gibco，Grand Island，NY，USA）的培养基筛选细胞，以获得稳定的细胞系。

4. 细胞计数试剂盒-8（CCK-8）法

• 根据制造商的说明[21]，使用CCK-8试剂盒（Dojindo Laboratories，熊本，日本）评估不同浓度的IL-1β对细胞活力的影响。 * 将细胞（2000个细胞/孔）接种到96孔板中，培养8小时。* 将培养基替换为新鲜培养基（100 μL）和CCK-8溶液（10 μL）的混合物。* 1小时后，使用Epoch酶标仪（BioTek，Winooski，VT，USA）在450 nm波长处检测光密度值。

5. 单丹磺酰尸胺（MDC）染色法

• MDC是一种特异性标记自噬泡的荧光染料。 MDC染色方法如下[20]：* 将6孔板中的成纤维细胞用葡萄糖胺处理，并与0.05 mM MDC孵育30分钟。* 用PBS冲洗细胞三次。* 使用荧光显微镜（BX51，Olympus，日本）观察并测量荧光强度。

总结

本文介绍了成纤维细胞的鉴定和处理方法，包括免疫荧光染色、基因沉默、细胞活力测定和自噬检测等实验技术，为相关领域的研究提供了参考。