你好请帮我修改以下语句中的语法错误并尽量减少文字PCR产物为带有酶切位点的3C全基因经12琼脂糖凝胶电泳检测在569 bp左右显示出目的条带结果与预期相符。对3C蛋白的诱导时间进行优化在37℃下选择1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h、7 h这7个不同的时间段进行诱导SDS-PAGE鉴定结果显示诱导时间为6 h时3C蛋白表达量最大。因此选择6h作为最佳诱导时间进行后续实验。将3C蛋白分别
PCR产物为带有酶切位点的3C全基因,经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测,在569 bp左右显示目的条带,结果符合预期。
优化3C蛋白的诱导时间,选择7个不同时间段(1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h、7 h)进行诱导,SDS-PAGE鉴定结果显示,6 h时3C蛋白表达量最大,因此选择6 h作为最佳诱导时间。
将3C蛋白在16℃、25℃、37℃温度中进行诱导,SDS-PAGE结果显示,在37℃条件下表达量最大,因此选择37℃作为3C重组蛋白的最佳诱导温度。
优化诱导3C重组蛋白的诱导剂浓度,将诱导剂浓度设置为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mmol/L,在37℃下诱导6 h,SDS-PAGE鉴定结果表明,3C重组蛋白在IPTG浓度为1.0 mmol/L表达量最大,综上,选择IPTG浓度为1.0 mmol/L,诱导温度为37℃,诱导时间为6 h进行后续实验。
将构建正确的重组质粒pET-32a-EV-G-3C转化入BL21(DE3)感受态细胞,利用IPTG诱导剂使其表达出3C重组蛋白,通过超声波细胞粉碎机破碎收集的菌液,SDS-PAGE电泳鉴定其上清和沉淀,结果显示,大部分3C重组蛋白在沉淀中表达,表明3C蛋白以包涵体的形式存在,蛋白表达量约为38.8 kDa,与预期结果相符。
使用梯度尿素溶解菌体裂解液沉淀后,利用His标签蛋白纯化试剂盒进行蛋白纯化,经SDS-PAGE分析鉴定,结果显示,获得的3C重组蛋白较为纯净,蛋白表达量大小约为38.8 kDa,与预期相符。
采用鼠抗His标签抗体对3C纯化蛋白进行Western blot鉴定,阴性对照为空载,结果显示,两者均在预期位置有特异性条带,表明3C纯化蛋白可被鼠抗His标签抗体识别,具有反应原性,可作为ELISA方法检测EV-G的候选蛋白。
抗体制备成功后,使用抗体纯化试剂盒得到纯化的多克隆抗体,并利用间接ELISA方法测定抗体的效价。每个稀释度重复三次,利用酶标仪读取每个稀释度下多克隆抗体孔OD450nm的数值(P)和阴性血清孔OD450nm的数值(N),计算每个稀释度下P的三个数值的平均值和N的三个数值的平均值。当比值(P/N)>2时,该比值下的多克隆抗体的最高稀释度即为该多克隆抗体的效价[68]。结果显示,纯化后的多抗效价达1∶8 192 000,表明,纯化后的重组3C蛋白能较好地诱导新西兰大白兔产生抗体。
3C蛋白多克隆抗体Western-blot鉴定结果显示,制备的兔抗3C血清能与3C重组蛋白特异性反应,在38.8 ku处出现特异性条带,表明制备的3C蛋白多克隆抗体能识别重组3C蛋白,可用于检测3C重组蛋白的表达。
间接免疫荧光试验结果表明,制备的多克隆抗体可对EV-G感染的细胞产生特异性绿色荧光信号,阴性血清则无反应,表明多克隆抗体能在体外细胞中特异性识别EV-G病毒,具有良好的间接荧光反应特异性,可用于鉴定EV-G毒株的检测性抗体
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