帮我翻译 Fibroblast identificationPassage 3 fibroblasts density of 1 × 105 cellswell were seeded into 12-well plates pre-coated with coverslips for 48 h 19 Cells on the glass were fixed with 4 paraformal

纤维母细胞鉴定 第3段纤维母细胞（密度为1×105个细胞/孔）在预先涂覆玻片的12孔板中孵育48小时[19]。玻璃上的细胞用4％的多聚甲醛固定10-15分钟，随后用3次PBS洗涤并用0.5％的Triton X-100处理10分钟。随后，细胞在3％的过氧化氢中孵育5分钟，浸入PBS，室温下用山羊血清阻断10分钟，然后在4℃过夜用初级抗体Pan-CK（ab215838; Abcam Inc.，剑桥，MA，美国）和Vimentin（ab8978，Abcam）培养。第二天，细胞在37℃下回温30分钟，浸泡在PBS中，在37℃下用二甲基氨基丁酸（ZSGB-BIO，中国北京）培养15分钟，用中性树脂密封，并在光学显微镜（OLYMPUS Optical Co.，Ltd，日本东京）下观察。 纤维母细胞处理 纤维母细胞经过不同浓度（0、0.5、1、5、10 ng/mL）的白细胞介素（IL）-1β（Peprotech，Rocky Hill，NJ，USA）或10 mmol/L 3-甲基腺嘌呤（3-MA）（Sigma-Aldrich，Merck KGaA，Darmstadt，德国）处理24小时[20]。为了下调纤维母细胞中Nampt的表达，采用了以下3种慢病毒（LV）包装的短发夹（sh）RNA（均采自中国上海基因化学有限公司，中国上海）：Nampt shRNA 1＃，Nampt shRNA 2＃和Nampt shRNA 3＃构建，LV包装的乱码负性shRNA作为对照。细胞（1×105个细胞/孔）在转染前24小时种植在6孔板中。随后，细胞孵育到大约50％的密度并在聚布烯中转染LV（5 μg/mL，感染率=10）12小时。之后，含LV的培养基被4 mL新鲜培养基替换。在72小时后，用含有普鲁霉素（4 μg/mL Gibco，Grand Island，NY，USA）的培养基重新筛选细胞以生成稳定的细胞系。 细胞计数试剂盒-8（CCK-8）法 使用CCK-8试剂盒（Dojindo Laboratories，熊本，日本）按照制造商的说明[21]评估不同浓度IL-1β对细胞存活率的影响。简要地说，细胞（2000个细胞/孔）在96孔板中培养8小时。然后，用新鲜培养基（100μL）和CCK-8溶液（10μL）的混合物替换培养基。一个小时后，使用Epoch Microplate分光光度计（BioTek，Winooski，VT，USA）检测450nm波长处的光密度。 单胺基磺酰卡瓦丁（MDC）染色法 MDC是一种荧光染料，作为自噬液泡的特异性标记物。因此，如先前所述进行了MDC染色法[20]。简要地说，6孔板中的纤维母细胞用葡萄糖胺处理，孵育0.05 mM MDC 30分钟，然后用PBS三次冲洗。之后，使用荧光显微镜（BX51，Olympus，日本）测量荧光强度