Another recent cryo-TEM based study 100 on the morphology of LNP-mRNA formulations determined that a few different populations of particles exist Specifically using a thionine stain for RNA in cryo-TE

进行的一项最近的基于冷冻电镜技术的LNP-mRNA制剂形态学研究[100]发现存在几种不同的粒子群体。具体来说，使用硫脲染色法在冷冻电镜中显示，RNA似乎定位在制剂的外缘（很可能夹在紧密相邻的脂质单层之间）或被围绕着双层突起的水相区域中。这项研究仍然是对LNP结构和组织的最直接分析，对LNP结构的物理干预非常有限。与使用冷冻保护剂相结合的超低温度和不受控制的冷冻相比，硫脲染色法是一种相对温和的探测LNP-RNA颗粒结构和定位的方法。在Kulkarni等人提出的基于夹在紧密相邻的脂质单层之间的siRNA的LNP模型中[94]，未与siRNA相互作用的离子化脂质可以在LNP中心形成无定形的油相（图6C）。去质子化的离子化脂质与磷脂和胆固醇等两性分子相比几乎完全是疏水的。一旦离子化脂质去质子化，它的行为类似于甘油三酯，因此很可能会相分离成脂滴。请注意，离子化脂质的游离基衍生物（例如图2A中描述的离子化脂质）在室温下存在为油。对于含有20 mol％离子化脂质KC2、31.5 mol％DSPC、47 mol％胆固醇和1.5 mol％PEG-脂质的LNP，两个明显的相（通过冷冻电镜可视化），包括一个被提出的包含未带电的离子化脂质的油相和一个水相（图6D）。中性离子化脂质倾向于相分离成为纯疏水环境的事实得到了在不同比例的KC2和POPC在pH∼4和∼7.5 pH下的双层中的MD模拟的支持[101]。在这项研究中，中性离子化脂质插入在POPC的疏水链的末端之间。一项有趣的单粒子荧光显微镜研究[102]表明，siRNA聚集体在LNP中以非均匀的分布聚集，与上述模型非常吻合（图6D）