AAV8样品中杂质的来源及表征

先前研究表明，图2中较小尺寸杂质（峰组1和2）的来源可能与宿主细胞或质粒相关的核酸片段有关。为了验证这一假设，本研究对完整和空载AAV8样品进行了分析，其中空载AAV8样品几乎不含病毒基因组。实验中，一部分样品使用苯酚酶处理，以消化病毒壳体外的所有核酸杂质。所有样品均经过100 kDa过滤器离心，残渣经蛋白酶K消化处理。随后，采用硫酸胍介导的方法纯化样品，并通过CGE-LIF进行分析。

表1列出了基于峰面积的定量结果。未经苯酚酶处理（-B）、蛋白酶K消化（+PK）和纯化（+gHCl）的空载AAV8载体显示出最高的较小尺寸核酸杂质含量（峰面积：133247），这代表了该样品中杂质的总量。而对相同的空载壳体进行苯酚酶处理（+B），随后进行过滤和蛋白酶K消化（+PK）以及纯化（+gHCl），则显著降低了检测到的核酸杂质含量（峰面积：59341）。

有趣的是，在两个空载壳体样品中均检测到了代表完整基因组的小峰，峰面积分别为802和691。这可能与制备过程相关，例如在碘代萘密度梯度超速离心过程中，少量完整壳体与空载壳体一同被收集。

作为对照，完整AAV8-4.5 kb样品也按照上述相同的方式进行了处理，包括苯酚酶处理（+B/-B）、蛋白酶K消化（+PK）和硫酸胍介导的样品纯化（+gHCl）。结果显示，在两种样品处理步骤后均检测到了几乎相同含量的完整基因组。值得注意的是，完整（9914和10161）和空载壳体（802和691）之间峰面积差异的测量可能为滴度测定提供了一种新的思路。

另一方面，在完整AAV8壳体分析中，经过苯酚酶处理（+B：1585）和未经处理（-B：2019）的样品中，较小尺寸杂质峰的峰面积值较低，表明样品纯度较高。此外，还检测到了一些较大尺寸的杂质，峰面积分别为909和619，分别对应经过苯酚酶处理的完整壳体样品和未经处理的完整壳体样品。这些结果为AAV基因组的完整性提供了补充信息。

综上所述，本研究结果表明，较大尺寸的杂质可能来源于壳体内部，而较小尺寸的杂质则存在于壳体内外。这些发现有助于深入了解AAV8样品的组成，并为优化AAV载体生产工艺提供参考。