如何利用荧光素酶报告基因验证miRNA靶基因？

利用荧光素酶报告基因验证hsa-miR-155对基因A的靶向作用

本实验旨在利用荧光素酶报告基因方法验证hsa-miR-155是否靶向已知的靶基因A。

实验原理

荧光素酶报告基因系统基于miRNA与其靶基因mRNA 3'UTR结合，抑制mRNA翻译或导致其降解的原理。构建包含靶基因A 3'UTR的荧光素酶报告基因载体，若hsa-miR-155能够靶向基因A，则其会抑制荧光素酶的表达，导致荧光素酶活性下降。

实验步骤

1. 构建荧光素酶报告基因载体

a. 根据基因A的3'UTR序列设计引物，扩增该序列。 b. 将扩增得到的基因A 3'UTR序列插入荧光素酶基因后方，构建荧光素酶报告基因载体。

2. 构建hsa-miR-155表达载体

a. 根据hsa-miR-155序列设计引物，扩增该miRNA序列。 b. 将扩增得到的hsa-miR-155序列插入适当的miRNA表达载体中。

3. 细胞系及转染

a. 选择合适的细胞系作为实验对象，将其分为三组。 b. 将荧光素酶报告基因载体转染至第一组细胞。 c. 将hsa-miR-155表达载体和荧光素酶报告基因载体共转染至第二组细胞。 d. 将空载体转染至第三组细胞作为阴性对照。

4. 荧光素酶活性检测

a. 收集转染后的细胞，进行荧光素酶活性检测。 b. 比较三组细胞中荧光素酶活性的差异，以确定hsa-miR-155是否影响基因A的表达。

结果分析

如果hsa-miR-155靶向基因A，则共转染hsa-miR-155表达载体和荧光素酶报告基因载体的细胞组中，荧光素酶活性将显著低于仅转染荧光素酶报告基因载体的细胞组。

注意事项

• 选择合适的细胞系和转染试剂，确保较高的转染效率。* 设置适当的对照组，例如空载体对照、miRNA阴性对照等。* 进行多次重复实验，确保结果的可靠性。* 可结合miRNA抑制剂实验进一步验证hsa-miR-155对基因A的靶向作用。

总结

利用荧光素酶报告基因方法可以有效验证miRNA对其靶基因的调控作用。本实验提供了一个验证hsa-miR-155是否靶向基因A的参考方案，研究者可根据实际情况对实验设计进行优化调整。