基于BCOADC-E4A点突变质粒构建的研究型实验教学探索

引言

原发性胆汁性肝硬化 (PBC) 是一种以中年女性为主要患病人群的器官特异性自身免疫性疾病，最终发展为肝硬化甚至肝癌 [1]，其特征是抗线粒体抗体 (AMA) 阳性 [2, 3]。近年来，PBC 的发病率呈上升趋势，但其病因尚不清楚，吸烟、免疫紊乱和尿路感染可能诱发 PBC [4]。PBC 的早期诊断和治疗非常重要 [5]。在 PBC 患者的血清中，抗线粒体抗体 (AMA) 的滴度很高 [6, 7]，可在 90% 以上的 PBC 患者中检测到 [8, 9]。因此，AMA 的检测对于 PBC 的诊断至关重要 [10, 11]。传统的 AMA 检测方法主要依赖于免疫荧光显微镜，该方法耗时长且特异性不高 [12, 13]。鉴于 AMAs 抗体的 M2 亚型 (AMA-M2) 可以与线粒体自身抗原特异性反应，且特异性接近 100% [5, 14]，因此可以通过 ELISA 检测快速有效地诊断 PBC [15–18]。目前，已知与 AMA-M2 特异性反应的线粒体自身抗原包括丙酮酸脱氢酶复合物 (PDC-E2)、支链 2-酮酸脱氢酶复合物 (BCOADC-E2) 和 2-酮戊二酸脱氢酶复合物 (OGDC-E2) [12, 19]，但主要与 PDC-E2 反应 [20, 21]。迄今为止，关于 BCOADC-E2 蛋白脂肪酰基结合域中蛋白质活性中心赖氨酸附近氨基酸突变对其与 AMA-M2 特异性结合的影响，尚未见相关研究 [22, 23]。因此，本研究以 BCOADC-E2 蛋白为基础开展相关实验。

在构成蛋白质的氨基酸中，某些氨基酸被丙氨酸取代往往会使蛋白质的功能发生较大变化，我们将这些对蛋白质功能有显著影响的氨基酸称为关键氨基酸。“丙氨酸扫描”是一种突变技术，将蛋白质的某个目标序列或多肽中的重要氨基酸残基替换为没有特殊侧链的中性丙氨酸，从而将编码任何氨基酸的三个碱基改变为编码丙氨酸的三个碱基 GCG 或 GCA 或 GCC 或 GCT。研究突变前后目标多肽特性的变化，可以识别关键氨基酸位点，指导氨基酸定点突变 [24]。

我们的实验设计是将 BCOADC-E2 脂酰基结合域活性中心赖氨酸前的第五个氨基酸谷氨酸突变为丙氨酸。BCKD 是一种从牛心脏组织中克隆的同源目标基因序列，能够表达含有 BCOADC-E2 脂酰基结合域的蛋白质。通过将 BCKD 与工程质粒 pGEX-4T1 重组，构建了重组质粒 pGEX-BCKD。在此基础上，通过 SOE PCR 成功构建了 pGEX-BCKD-E4A 点突变质粒 [25–28]，为后续研究 BCOADC-E2 蛋白活性中心赖氨酸周围氨基酸突变对其与 AMA-M2 特异性结合的影响提供了经验和依据 [29]。这对于深入研究 BCOADC-E2 关键氨基酸在 PBC 诊断和治疗中的作用具有重要意义。

同时，我们以此为基础，将科研内容转化为研究型实验教学项目，旨在激发学生学习专业知识的兴趣，帮助学生掌握实验研究的基本方法，培养学生的科学思维和创新意识 [30, 31]。微生物分子生态学实验技术是扬州大学环境科学与工程学院 2018 年面向农业资源与环境专业一年级研究生开设的一门选修实验课。与其配套的理论课程是分子生物学。这两门课程作为选修课面向对分子生物学感兴趣的学生。同时，依赖相关分子生物学实验技术已成为解决其他专业领域问题的重要途径。例如，开展“蚯蚓肠道微生物群落结构对四环素降解的影响”研究的学生就选修了这两门课程。在进行本实验之前，开设了分子生物学理论课，共计 12 学时（每学时约 2 小时），每周进行 2 学时的教学。对实验中涉及的理论知识进行了重点讲解。为了让同学们更多地了解分子生物学的 cutting-edge 进展，在此期间，还特别邀请了加州大学戴维斯分校的 Liang 教授，给大家做了共计 4 个学时的全英文授课，取得了良好的效果。目前开展的是与 DNA 重组技术相关的重组质粒构建与突变实验——构建 pGEX-BCKD 重组质粒，并以此为模板，通过重叠延伸 PCR (SOE PCR) 技术，构建 pGEX-BCKD-E4A 点突变质粒，用于后续研究。

实验设计

整个实验可以概括为以下六个部分（表 1），每个部分都由专门的老师或实验指导老师进行指导。每位研究生都需要独立完成实验。在本实验中，虽然在分子生物学课程中已经详细介绍了理论知识，但在实验中，特别是对 EB 等一些危险试剂的使用和防护，要再次强调操作要点。