基于BCOADC-E2蛋白突变的原发性胆汁性胆管炎诊断方法研究与教学应用

引言

原发性胆汁性胆管炎 (PBC) 是一种器官特异性自身免疫性疾病, 主要影响中年女性, 并最终发展为肝硬化甚至肝癌 [1], 其特征是抗线粒体抗体 (AMA) 阳性 [2, 3]。近年来发病率呈上升趋势, 但病因尚不清楚, 吸烟、免疫紊乱和尿路感染可能诱发PBC [4]。PBC的早期诊断和治疗非常重要 [5]。在PBC患者的血清中, 抗线粒体抗体 (AMAs) 的特征是滴度高 [6, 7], 在90%以上的PBC患者中均可检测到 [8, 9]。因此, AMAs的检测对PBC的诊断至关重要 [10, 11]。传统的AMAs检测方法主要依靠免疫荧光显微镜, 该方法耗时长且特异性不高 [12, 13]。根据AMAs抗体的M2亚型 (AMA-M2) 可以与线粒体自身抗原特异性反应, 且特异性接近100% [5, 14], 可以通过ELISA检测快速、高效地诊断PBC [15–18]。目前已知的与AMA-M2特异性反应的线粒体自身抗原包括丙酮酸脱氢酶复合物 (PDC-E2)、支链2-酮酸脱氢酶复合物 (BCOADC-E2) 和2-酮戊二酸脱氢酶复合物 (OGDC-E2) [12, 19], 但主要与PDC-E2反应 [20, 21]。到目前为止, 还没有关于BCOADC-E2蛋白脂肪酰基结合域中蛋白质活性中心赖氨酸附近氨基酸突变对其与AMA-M2特异性结合影响的相关研究 [22, 23]。因此, 本研究以BCOADC-E2蛋白为基础开展相关实验。

构成蛋白质的氨基酸中, 某些氨基酸被丙氨酸取代往往会使蛋白质的功能发生较大变化, 我们将这些对蛋白质功能有显著影响的氨基酸称为关键氨基酸。“丙氨酸扫描”是一种突变技术, 它将蛋白质的某个目标序列或多肽中的一个重要氨基酸残基替换成没有特殊侧链的中性丙氨酸, 从而将编码任何氨基酸的三个碱基改变成编码丙氨酸的三个碱基GCG或GCA或GCC或GCT。研究突变前后目标多肽特性的变化, 可以识别关键氨基酸位点, 指导氨基酸定点突变 [24]。

我们的实验设计是将BCOADC-E2脂酰基结合域活性中心赖氨酸前面的第五个氨基酸谷氨酸突变成丙氨酸。BCKD是从牛心脏组织中克隆的同源靶基因序列, 能够表达含有BCOADC-E2脂酰基结合域的蛋白质。通过将BCKD与工程质粒pGEX-4T1重组构建重组质粒pGEX-BCKD。在此基础上, 通过SOE PCR成功构建了pGEX-BCKD-E4A点突变质粒 [25–28], 为后续研究BCOADC-E2蛋白活性中心赖氨酸周围氨基酸突变对其与AMA-M2特异性结合的影响提供了经验和依据 [29]。这对于深入研究BCOADC-E2的关键氨基酸对PBC的诊断和治疗具有重要意义。

同时, 我们以此为基础, 将科研内容转化为研究型实验教学项目, 旨在激发学生学习专业知识的兴趣, 帮助学生掌握实验研究的基本方法, 培养学生的科学思维和创新意识 [30, 31]。微生物分子生态学实验技术是扬州大学环境科学与工程学院2018年面向农业资源与环境专业一年级研究生开设的一门选修实验课。与其配套的理论课程是分子生物学。这两门课程是面向对分子生物学感兴趣的学生开设的选修课。同时, 依靠相关的分子生物学实验技术已经成为解决其他专业领域问题的重要途径。例如, 开展“蚯蚓肠道微生物群落结构对四环素降解的影响”研究的学生就选修了这两门课程。在进行本实验之前, 已经开设了分子生物学理论课, 共计12学时 (每学时约2小时), 每周进行2学时的教学。并对实验中涉及的理论知识进行了特别讲解。为了让同学们更多地了解分子生物学的 cutting-edge 进展, 在此期间, 特别邀请了加州大学戴维斯分校的梁教授给大家做了总共4个学时的全英文授课, 取得了良好的效果。目前开展的是与DNA重组技术相关的重组质粒构建与突变实验—pGEX-BCKD重组质粒的构建, 并以此为模板, 采用基因拼接重叠延伸PCR (SOE PCR) 技术构建pGEX-BCKD-E4A点突变质粒, 用于后续研究。

实验设计

整个实验可概括为以下六个部分 (表1), 每个部分都由专门的老师或实验指导老师指导。每位研究生都需要独立完成实验。在本实验中, 虽然在分子生物学课程中已经详细介绍了理论知识, 但在实验中, 还是要再次强调操作的重点, 特别是一些危险试剂, 如EB的使用和防护。

结论

本研究以AMA-M2抗体为基础, 研究了BCOADC-E2蛋白氨基酸突变对其与AMA-M2特异性结合的影响, 旨在为PBC的早期诊断提供新的思路。研究结果应用于研究生实验技术课程教学, 提高了学生的理解能力和实践能力, 取得了显著的教学效果。