基于毛细管凝胶电泳-激光诱导荧光检测法快速分析腺相关病毒基因组

本文研究了一种基于毛细管凝胶电泳-激光诱导荧光检测法 (CGE-LIF) 的快速分析腺相关病毒 (AAV) 基因组的方法。首先，将标准工作流程（图1，上方轨迹）应用于一个基因组大小为4.5 kb的AAV8样本，并通过CGE-LIF对释放的核酸进行分析。该样品制备过程以苯酚酶消化为起点。利用这种非选择性内切酶，将样品中AAV壳外可能存在的所有核酸杂质（可能来源于降解的宿主细胞和/或质粒载体），例如DNA和RNA，分解成非常短的寡核苷酸（约4-6个碱基）。消化步骤完成后，使反应混合物通过100 kDa截断值过滤器进行过滤，以去除苯酚酶和消化的小分子核酸。含有AAV壳体的过滤残渣经蛋白酶K处理以释放其基因组，然后在CGE-LIF分析之前，通过硫酸胍介导的DNA纯化方案进行清理。图2中的上方迹线显示了按照标准方案提取的AAV8基因组的电泳图。由于缺乏市售的、大小范围高达10 kb的单链DNA标准品，我们使用了一个RNA梯度（0.2-10.0 kb，图中的上x轴给出了片段大小），并假设单链RNA物种的迁移方式与其对应的单链DNA类似。基于大小评估，我们初步估计，峰1和峰2分别为0.5-0.9 kb和0.9-1.3 kb范围内的小尺寸杂质，而峰3是4.5 kb的AAV8病毒载体完整基因组。小的峰5和峰6可能是完整基因组的不同二级结构形式。根据连续八次运行的结果，图2中目标组分的迁移时间和峰面积的重现性（迹线a，峰1、2、3和4）分别为≤0.33% RSD和≤2.06% RSD。为了缩短标准工作流程约2.5小时的时间，我们还评估了一种加速简化的样品制备方法（图1中的下方轨迹）。在这种情况下，AAV8-4.5 kb样品既不经过苯酚酶消化，也不经过蛋白酶K处理，而是使用实验部分描述的方法，通过离心柱进行纯化。显然，纯化结合缓冲液中的硫酸胍含量足以打开壳体，释放其DNA含量，以进行下游CGE-LIF分析。在这种情况下，整个样品制备和CGE-LIF分析过程不到30分钟。图2中的迹线b显示了一个与迹线a非常相似的电泳图（使用的是标准的样品制备方法），但信号强度稍有下降。在迹线b中，峰2比迹线a中的对应峰更宽，这表明该方法无法去除来自壳外的一些核酸杂质。在迹线b中，峰5作为峰4的尾随肩部迁移，而峰6几乎不可见。如果可以接受这种轻微的灵敏度下降，该加速方法可以作为一种快速的过程分析技术应用于AAV生产过程中，但需理解壳外核酸与内部核酸会同时被测量。请注意，可以优化快速方法中的进样参数以提高检测灵敏度。