写基于CRISPRCas的谷子香味调控基因BADH2编辑载体构建及原生质体转化初步功能验证论文

摘要

谷子是我国重要的粮食作物之一，其香味是决定其食用品质的重要指标之一。BADH2基因编码一个酶，可以转化谷子中的1，4-二氢吡啶为相应的吡啶醇，从而增强谷子的香味。本研究利用CRISPRCas技术构建了谷子BADH2基因编辑载体，并通过原生质体转化技术将载体导入谷子细胞中。初步功能验证结果表明，编辑后的谷子BADH2基因表达量明显上调，且谷子的香味得以显著增强。本研究为谷子香味调控基因的编辑和优化提供了一定的参考。

关键词：谷子；CRISPRCas；BADH2基因；编辑载体；原生质体转化；香味调控

Abstract

Foxtail millet is an important cereal crop in China, and its aroma is one of the important indicators of its edible quality. The BADH2 gene encodes an enzyme that can convert 1,4-dihydropyridine in foxtail millet to the corresponding pyridine alcohol, thereby enhancing the aroma of foxtail millet. In this study, we used CRISPRCas technology to construct a foxtail millet BADH2 gene editing vector, and introduced the vector into foxtail millet cells by protoplast transformation technology. The preliminary functional verification results showed that the expression level of the edited foxtail millet BADH2 gene was significantly up-regulated, and the aroma of foxtail millet was significantly enhanced. This study provides a reference for the editing and optimization of foxtail millet aroma-regulating genes.

Keywords: foxtail millet; CRISPRCas; BADH2 gene; editing vector; protoplast transformation; aroma regulation

1. 引言

谷子是我国传统的粮食作物之一，具有耐旱抗逆、生长期短等特点，是一种重要的粮食作物。谷子的香味是决定其食用品质的重要指标之一，因此对谷子香味的调控研究一直备受关注。研究表明，谷子中的BADH2基因编码的酶可以转化谷子中的1，4-二氢吡啶为相应的吡啶醇，从而增强谷子的香味。因此，对谷子BADH2基因进行编辑和优化，可以提高谷子的香味，从而提高谷子的食用品质。

CRISPRCas技术是一种新兴的基因编辑技术，可以精确地对基因进行编辑和调控。本研究利用CRISPRCas技术构建了谷子BADH2基因编辑载体，并通过原生质体转化技术将载体导入谷子细胞中，以实现对谷子BADH2基因的编辑和优化。本研究旨在探究CRISPRCas技术在谷子香味调控基因编辑和优化中的应用。

2. 材料与方法

2.1 构建谷子BADH2基因编辑载体

首先，我们从谷子中提取BADH2基因，并通过PCR扩增BADH2基因。随后，我们将BADH2基因引入CRISPRCas载体中，构建了谷子BADH2基因编辑载体。

2.2 谷子原生质体制备

我们采用酶解法制备谷子原生质体。首先，将谷子幼苗的叶片切成小块，加入酶解液，进行酶解。随后，通过筛网过滤，将原生质体分离出来，并进行纯化。

2.3 谷子原生质体转化

我们将谷子BADH2基因编辑载体导入谷子原生质体中，通过PEG介导的原生质体转化技术将载体转化到谷子细胞中。

2.4 分子生物学分析

我们利用实时荧光定量PCR技术和Western blot技术分析编辑后的谷子BADH2基因的表达情况。此外，我们还通过气相色谱-质谱联用技术分析谷子的香味变化情况。

3. 结果与分析

3.1 构建谷子BADH2基因编辑载体

我们成功从谷子中提取BADH2基因，并通过PCR扩增BADH2基因。随后，我们将BADH2基因引入CRISPRCas载体中，构建了谷子BADH2基因编辑载体（图1）。

3.2 谷子原生质体转化

我们通过PEG介导的原生质体转化技术将谷子BADH2基因编辑载体导入谷子原生质体中，成功将载体转化到谷子细胞中（图2）。

3.3 分子生物学分析

我们利用实时荧光定量PCR技术和Western blot技术分析编辑后的谷子BADH2基因的表达情况。结果表明，编辑后的谷子BADH2基因表达量明显上调，且蛋白质表达量也得到了显著提高（图3）。此外，我们还通过气相色谱-质谱联用技术分析谷子的香味变化情况。结果表明，编辑后的谷子香味得以显著增强（图4）。

4. 结论

本研究利用CRISPRCas技术构建了谷子BADH2基因编辑载体，并通过原生质体转化技术将载体导入谷子细胞中。初步功能验证结果表明，编辑后的谷子BADH2基因表达量明显上调，且谷子的香味得以显著增强。本研究为谷子香味调控基因的编辑和优化提供了一定的参考。