AAV 样本核酸杂质去除与基因组纯化流程

AAV 样本中的核酸杂质在 20 µL 反应体积中被消化，其中包含 10 µL 样品，7 µL 配方缓冲液，2 µL 的 10 倍稀释的 DNase I 缓冲液，以及 1 µL 十倍稀释的 1× DNase I 缓冲液中的苯酚酶，该缓冲液含有 10 mM Tris‑HCl（pH 7.5），2.5 mM MgCl2 和 0.1 mM CaCl2。所有消化反应在 37°C 下进行 30 分钟，并通过加入 2 µL 的 50 mM EDTA 和 278 µL 的 AAV 配方缓冲液来终止反应。苯酚酶和任何降解的核酸通过在 Amicon 离心过滤器（100 kDa 截断值）中以 14000×g 离心 2 分钟来去除。通过翻转过滤单元来收集残留物，以 1000×g 离心 2 分钟，并用 AAV 配方缓冲液（95 µl）稀释。通过添加 5 µL 浓度为 20 mg/ml 的蛋白酶 K 并在 37°C 下孵育 2 小时来解离 AAV 壳体。释放的 AAV 基因组通过包含硫酸胍的 QIAquick PCR 纯化试剂盒进行纯化，并用 30 µL 无核酸的水洗脱。洗脱的样品在 70°C 下孵育 2 分钟后，放在冰上进行 CGE–LIF 分析之前。