基于毛细管凝胶电泳的腺相关病毒基因组完整性和纯度分析

腺相关病毒（AAV）是一种直径约为20纳米的无包膜二十面体蛋白壳，其内部包裹着一个长度约为4.7千碱基的单链DNA基因组（1）。AAV载体因其无致病性、低免疫原性、对多种细胞类型具有广泛的趋向性以及能够在分裂和静止细胞中持久表达转基因等特点而备受关注（2）。因此，AAV被认为是治疗多种疾病的有效载体（3）。重组AAV的基因组包含两个反向末端重复序列（ITR），它是病毒复制和包装所必需的；一个启动子区域，用于调控转基因的表达；编码治疗性蛋白的转基因；以及一个用于RNA稳定的多聚腺苷酸化信号（4）。由于携带转基因的AAV基因组中不存在Rep和Cap基因片段，因此它是复制缺陷型的。

AAV生产过程中面临的一个主要挑战是在基因组完整性水平上对产品相关杂质进行表征和鉴定，因为病毒载体内部的质量可能会影响其感染效率、治疗效果和安全性（5）。此类质量问题中最重要的是转基因基因组不存在或仅部分存在（截短）；或者病毒衣壳中包含宿主细胞基因组或质粒DNA的片段。因此，基因组完整性和纯度分析至关重要，需要采用灵敏、可靠且分辨率高的方法。

目前用于此类分析的技术包括变性琼脂糖凝胶电泳、Southern印迹法、定量聚合酶链反应（qPCR）、尺寸排阻高效液相色谱（SEC-HPLC）和下一代测序（6）。变性琼脂糖凝胶电泳是一种成本低廉且易于操作的方法，但耗时且精度有限（7）。Southern印迹法是另一种传统技术，可以确认目标基因的存在并确定其大小，但精度较低且无法检测杂质（8）。实时聚合酶链反应（PCR）可以快速定量目标AAV基因组序列，但不能提供大小信息，也无法检测不含目标序列的片段（9,10）。SEC-HPLC具有良好的灵敏度、重现性和对完整基因组以及病毒衣壳中其他DNA片段的定量能力，但缺乏足够的尺寸评估能力（11）。最后，下一代测序可以确定AAV基因组以及任何污染物的序列，但在生物制药行业中难以作为常规质量控制测试（12）。

毛细管凝胶电泳（CGE）是一种成熟的自动化生物分析方法，尤其适用于核酸分离领域，并在人类基因组的初步测序中得到广泛应用（13）。配备激光诱导荧光（LIF）检测器后，通常可以获得低至10-11 M的检测限（14）。在本文中，我们介绍了一种标准化和加速化的样品制备流程（图1），结合CGE-LIF分离技术，用于AAV基因组完整性和纯度分析。