毕赤酵母基因表达优化指南：培养基、蛋白酶和通气

这一部分的目的是确定您的基因表达的最佳方法和条件。在开始在毕赤酵母中表达之前，需要考虑以下一些因素和指导方针。与任何表达系统一样，最佳的表达条件取决于被表达的蛋白质的特性。

培养基：您将需要BMGY/BMMY（缓冲的复合甘油或甲醇培养基）、BMG/BMM（缓冲的最小甘油或甲醇培养基）或MGY/MM（最小甘油或最小甲醇培养基）来进行表达（参见附录，第68-70页）。BMG、BMM、BMGY和BMMY通常用于表达分泌的蛋白质，特别是如果pH对蛋白质的活性很重要。与MGY和MM不同，它们都是缓冲培养基。由于这些培养基使用磷酸盐缓冲液，您可以使用各种pH值来优化蛋白质的产量。BMGY/BMMY含有酵母提取物和胨蛋白，可以帮助稳定分泌的蛋白质，并防止或减少分泌的蛋白质的蛋白酶解。酵母提取物和胨蛋白的添加作用类似于'混合饲料'，可以促进生长和生物量积累。

蛋白酶：有些蛋白质特别容易受到蛋白酶的影响，在中性pH下具有最佳活性。如果是这种情况，可能需要使用MGY和MM培养基进行表达。当毕赤酵母在像MM这样的不缓冲的培养基中进行表达时，pH会降至3或更低，使许多中性pH的蛋白酶失活（Brierley等，1994年）。毕赤酵母对低pH具有耐受性，因此低pH不会影响生长。相反，有报道称通过添加1%的胨氨基酸（Difco）并将培养基缓冲至pH 6.0，可以抑制细胞外蛋白酶，增加小鼠表皮生长因子的产量（Clare等，1991b年）。

如果您了解到您感兴趣的蛋白质特别容易受到中性pH蛋白酶的影响，您可能希望在不缓冲的培养基（MM）中进行表达。如果没有证据表明您感兴趣的分泌蛋白质在中性pH下容易受到蛋白酶的影响，我们建议您首先在BMMY中进行表达。如果表达的蛋白质被降解，您可以尝试在不缓冲的培养基中进行表达。

如果上述选项无法保护您的蛋白质免受降解，您可能希望将基因转化到SMD1168中。这个菌株的基因型为his4 pep4，缺乏蛋白酶A的活性。您可以使用与将GS115转化和表达相同的方法处理SMD1168。您也可以在大规模发酵中使用这个菌株。

通气：在毕赤酵母中，充足的通气是高效表达的最重要的参数。一般规则是，在诱导表达时，不要让培养物超过瓶子总体积的10-30%。我们强烈建议使用有隔板的瓶子。请参见附录，第71页。