翻译：The results showed that while doxorubicin induced the senescence of breast cancer cellsthe polarization ratio of M2 TAMs in the immune microenvironment changed significantly Inorder to further veri

结果显示，阿霉素诱导了乳腺癌细胞的衰老，而M2型肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）的极化比例在免疫微环境中发生了显著变化。为了进一步验证乳腺癌化疗耐药、衰老和免疫微环境变化之间的关系，我们在自发性肿瘤形成的MMTV-PyMT小鼠上进行了体内验证，空白对照组腹腔注射生理盐水，此外设置了两组小鼠，两组小鼠均腹腔注射100 mg/ml的阿霉素，按体重每只小鼠注射4 mg/kg。一周后，化疗后执行衰老耐药组（Senescence），另一组停药4周，当肿瘤体积再度增大时执行，模拟化疗后耐药复发组（Recurrence）。在给药期间记录小鼠的体重和肿瘤体积，并在牺牲后收集小鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏和肿瘤进行免疫组织化学染色。结果显示，停药后肿瘤体积增大，衰老后复发组出现明显的肺转移，衰老指标DCR2和γh2AX增加，M2型巨噬细胞标记物CD163也增加。

超声分子靶向微泡的基本特征检测和生物安全性验证 本实验使用的超声分子靶向微泡DCR2-FITC-NBs内部充满了全氟丙烷气体（C3F8），外层是一个脂质分子壳，衰老靶向标记物DCR2耦合在脂质分子壳的表面上。同时连接了绿色荧光FITC，并使用连接到绿色荧光FITC的BSA抗体作为对照。在透射电子显微镜下观察到BSA-FITC-NBs和DCR2-FITC-NBs呈圆形，均匀分布且分散良好。BSA-FITC-NBs的粒径约为700 nm，电位为-22.6±13.3 mV。DCR2-FITC-NBs的粒径约为800 nm，电位为-23.2±14.9 mV。

为了验证超声分子微泡靶向衰老细胞的能力，我们将BSA-FITC-NBs和DCR2-FITC-NBs与MCF7细胞和衰老细胞M7-SE共培养。通过免疫荧光实验，我们发现DCR2-FITC-NBs能够靶向衰老细胞，并明显聚集在肿瘤衰老细胞膜附近，细胞质中也可以看到明显的绿色荧光；此外，DCR2-FITC-NBs与衰老细胞的结合率显著高于正常细胞。然而，BSA-FITC-NBs在正常和衰老细胞周围没有明显的绿色荧光聚集。接下来，我们使用超声成像设备测试了BSA-FITC-NBs和DCR2-FITC-NBs的体外成像效果，DCR2-FITC-NBs靶向微囊的成像效果非常好。最后，我们将BSA对照微泡和超声靶向微泡注射到C57小鼠的尾静脉中一周，然后解剖小鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏进行HE染色实验，发现BSA-FITC-NBs和DCR2-FITC-NBs对小鼠心脏、肝脏、脾脏的形态结构没有显著差异。

体外实验证明小分子抑制剂Verteporfin对衰老细胞表型的抑制作用 为了筛选出可以与化疗增敏剂协同作用并促进肿瘤衰老细胞凋亡的小分子抑制剂，我们在实验前阅读和调查了大量文献，并选择了Verteporfin进行实验。Verteporfin是一种吞噬抑制剂，可以抑制细胞增殖并诱导凋亡，同时也是YAP1的小分子抑制剂。同时，YAP1的过表达可以增加HUVEC和血管组织的衰老，因此我们认为YAP1也参与了肿瘤衰老细胞的过程。然后，通过STRING数据库蛋白相互作用网络分析了YAP1、p16 INK4a/pRb和p53/p21CIP1肿瘤抑制途径以及DCR2的主要分子蛋白，并发现YAP1与它们密切相关。

首先，为了探索小分子抑制剂Verteporfin诱导乳腺癌细胞凋亡的适当浓度，我们使用CCK-8细胞毒性实验处理MCF7乳腺癌细胞，将Verteporfin处理48小时，计算药物作用后的细胞浓度。半抑制浓度IC50为2669 nM，选择2500 nM或2.5 μM的浓度作为Verteporfin的工作浓度。然后，MCF7细胞经Verteporfin和阿霉素处理，探究小分子抑制剂Verteporfin在促进肿瘤衰老细胞凋亡中的作用。CCK-8和流式细胞术实验结果显示，与空白对照组和单药治疗组相比，Verteporfin与阿霉素联合治疗组的凋亡效果明显。同时，WB实验结果显示，Verteporfin可以在蛋白水平上降低肿瘤衰老细胞中的p16、p21和DCR2，并上调核骨架蛋白Lamin B1。

此外，将阿霉素诱导的衰老M7-SE细胞与Verteporfin处理并与极化的THP1细胞共培养48小时，进行流式细胞术表型分析。结果显示，与M7-SE衰老细胞共培养组相比，Verteporfin处理的共培养组中M2型肿瘤相关巨噬细胞的极化比例显著降低，表明Verteporfin可以诱导衰老细胞凋亡，防止衰老细胞的逃逸，下调衰老指标，并改变肿瘤免疫微环境中巨噬细胞的M2型极化趋势