DNA甲基化调控ARAP1-S启动子活性研究：靶向编辑技术验证因果关系

为了进一步研究DNA甲基化与选择性启动子活性之间的因果关系，本研究使用了DNA甲基化抑制剂（5-氮杂胞嘧啶核苷，5AzaC）处理HepG2细胞。结果显示，5AzaC显著降低了HepG2中ARAP1-S启动子区的甲基化状态，并且增加了ARAP1-S的表达。这进一步加强了DNA甲基化与选择性启动子活性之间的关联。然而，同时ARAP1-L的表达也显著增加了。通过对启动子区域三的检测，发现其甲基化状态并未显著下降。我们推测ARAP1-L的表达增加可能是因为5AzaC作为广谱DNA甲基化抑制剂，对HepG2中除ARAP1以外的基因也产生了影响，最终通过某些复杂的调控机制导致了ARAP1-L的表达上调。为了避免这种非特异作用引起的干扰，我们采用了DNA甲基化靶向编辑技术对HepG2进行了处理。我们设计了3条针对ARAP1-S启动子区域的sgRNA，并通过慢病毒逐步感染的方式将Fuw-dCas9-Tet1CD系统和sgRNA系统整合到HepG2细胞中，构建了靶向ARAP1-S去甲基化的稳定转染细胞。BSP检测结果显示，与sgRNA-blank组相比，sgARAP1-S#1组和sgARAP1#3组成功降低了ARAP1-S启动子区域的DNA甲基化水平，并相应增加了ARAP1-S的表达量。而在ARAP1-L区域，未观察到显著的DNA甲基化水平改变，其表达量也没有显著变化。这一结果有效地证实了ARAP1-S的启动子活性受到DNA甲基化的调控。