免疫荧光技术在阴道组织和成纤维细胞研究中的应用

免疫荧光技术在阴道组织和成纤维细胞研究中的应用

免疫荧光是一种利用抗体与荧光染料结合，特异性地标记细胞或组织中目标抗原的技术。该技术广泛应用于生物医学研究中，用于检测蛋白质的表达和定位。

本文介绍了如何利用免疫荧光技术对阴道组织和成纤维细胞进行染色和观察，并使用ImageJ软件进行定量分析。

1. 阴道组织免疫荧光染色

根据先前的文献[22]，取得前阴道壁组织切片（5μm），在60℃的烤箱中烘烤1小时。接下来，使用水、二甲苯和不同浓度的乙醇（100%, 90%, 80%和70%）去蜡，并使用微波或柠檬酸抗原提取溶液进行抗原提取。随后，用PBS三次冲洗切片，用5%牛血清白蛋白在PBS中封闭30分钟，然后在4℃过夜孵育抗Nampt抗体（ab236874, Abcam）。第二天，将切片在室温下孵育1小时，使用山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）（Alexa Fluor® 488, ab150077, Abcam）进行孵育。接下来，采用4,6-二氨基-2-苯基吲啶（DAPI, 现成, Servicebio, 湖北武汉, 中国）进行细胞核染色。染色后，使用LSM-710激光扫描共聚焦显微镜（Garl Zeiss，德国耶拿）拍摄图像。使用ImageJ软件（版本1.50i，美国国立卫生研究院，马里兰州贝塞斯达）确定荧光信号的面积分数。

2. 成纤维细胞免疫荧光染色

成纤维细胞在6孔板中播种，在达到70%的细胞密度后收集[21]。经过3次PBS清洗后，用4%甲醛固定细胞15分钟，用0.5% Triton X-100渗透5分钟，然后用5%山羊血清封闭30分钟。随后，将细胞与以下初级抗体一起孵育：胶原I型（COL1A）（ab96723, Abcam），硫酸软骨素（ACAN）（MA3-16888, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA）和轻链3（LC3）（ab192890, Abcam），在4℃过夜。清除后，将细胞与二级抗体山羊抗兔IgG H&L（ab150077, Abcam）或山羊抗小鼠IgG H&L（ab150113, Abcam）一起孵育。然后，用DAPI染色细胞核，并使用共聚焦显微镜固定和成像，并使用ImageJ软件进行分析。

3. RT-qPCR

如先前所述[23]，使用TRIzol试剂（Invitrogen Inc., 加州卡尔斯巴德）从前阴道壁组织和成纤维细胞中提取总RNA含量。使用PrimeScriptTM RT试剂盒（TaKaRa Biotech, 中国大连）将总RNA反转录成cDNA。随后，使用SYBRR Premix Ex TaqTM II试剂盒（TaKaRa）进行qPCR。采用SYBR绿色实时荧光定量PCR混合物（每个正反引物7.5μM），其中甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）作为内参基因。使用2-ΔΔCt方法[24]计算基因的相对表达。使用的引物如表1所示。

关键词: 免疫荧光, 阴道, 成纤维细胞, ImageJ, Nampt, 胶原蛋白, 硫酸软骨素, RT-qPCR